(自己整理)实验室常用技术

1、.实验室常用技术资料Lab. experiment technologyLQ细胞冻存1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射30min；吹打管、中枪头、中枪、培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液2用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入1.5ml胰蛋白酶消化。3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心1000r/min，8分钟。(可以留下一部分细胞悬液在培养瓶中继续培养)5. 用中枪吸去上清液直至冻存管内剩余1ml培养液，加入

2、110ulDMSO(二甲基亚枫)，用枪头轻轻吹打使细胞均匀。6. 冷存管置于430min-2030min-801618小时(或隔夜)-液氮槽长期储存。(-20不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80冰箱中，惟存活率稍微降低一些)。7记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。细胞复苏冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常。1 材料：37 恒温水浴箱，新鲜培养基，无菌吸管/ 离心管/ 培养瓶 2 步骤： 1、操作人员应戴防护面

3、罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。 2、自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。 3、取出冷冻管，立即放入37 C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化。4、常温离心1000rpm，5min，以70% 酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内，去除上清夜，加入新鲜培养基，重悬细胞。5、取出细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养瓶，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。G418和筛选1、筛选之前由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。1.G418的配制：

4、取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量（10000个/ml）接种入24孔培养板中，过夜培养，开始加药。3.制备筛选培养基：在100ug/ml1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml、400ug/ml。1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。4.加G418筛选:吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每35天更换一次筛选培养基。方法同4。

5、6.确定最佳筛选浓度：在筛选1014天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。一般400-左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。2、确定了最佳筛选浓度后做稳定转染1、转染：选取对数生长期细胞，接入平皿（4X105个/ml,5ml）,转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，接入12孔板，继续培养，待细胞密度增至5070汇合。2、加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。3、换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每35天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。筛选1

6、014天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大。4、挑单克隆：显微镜下观察单克隆，加入胰酶消化，将单克隆吸入96孔板（每孔接1个克隆），加培养液继续培养。待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。（及早冻存）5、单克隆鉴定：细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。Lf2000转染：质粒DNA转染转染前应筛选合适的DNA:Lf2000转染比例。一般按照1:1，2:1，3:1进行筛选。选择转染比率最高者为合适比例。筛选合适的细胞汇合度，看高汇合度还是低汇合度转染效率高。筛选时注意观察最佳转染时间。以下操作以24孔板为例：1、 贴壁细胞： 转染前一天，去不含抗生素的培养液

7、500ul接于培养板(细胞密度0.5-2X105个/ml)，转染时细胞融合可到90-95%。悬浮细胞：准备转染前取即可，取500ul细胞悬液（4-8X105个/ml），培养液不含抗生素。2、 准备混合物：A：将DNA稀释于50ulOpti中，轻柔混匀。B：使用前轻柔混匀Lf2000，取合适剂量用50ulOpti 稀释，室温放置20min(注意：到stepC时要在25min内完成)。C：加入A和B，轻柔混匀，室温放置20min.3、 每孔中加入100ul混合物，前后晃动培养板，轻柔混匀。4、 培养箱培养18-48h，转然后4-6h换液。PBS配制500ml NaCl 4g KCl 0.1g Na

8、2HPO4.12H2O 1.7907gKH2PO4 0.12g用400ml蒸馏水溶化，HCL/NaOH调PH至7.3-7.4，加水至500ml,高压灭菌。胰酶配制 1、PBS 500ml 胰酶 1.25g EDTA 0.1g 搅拌4h2、滤膜、滤纸用双蒸水浸泡2h,3、装好滤器，勿按紧，包好，晾干后高压。4、略烤干5、层流室过滤6、分装到高压过的小瓶7、-20C保存备用，同时做无菌试验。CuSO4配制 2% CuSO4 1500ml 硫酸铜 30g 双蒸水 1500ml 高压灭菌后，将液体倒入37C恒温箱。双抗配制 青霉素 100u/ml培养液，链霉素100ug/ml培养液 青霉素 100万单

9、位 链霉素 1g PBS 100ml配制后浓度为10000u/ml，使用时取10ul/ml培养液。电泳缓冲液TAE配制 贮存液（50X），1 L Tris 碱 242g 冰乙酸 57.1ml 0.5mol/l EDTA(PH8.0) 100ml 加水定容至1L ALB培养基配制（400ml）细菌培养用蛋白胨 4g细菌培养用酵母提取物 2g氯化钠 4g预先在三角烧瓶中加入200ml双蒸水，将上述配方加入其中，搅拌。5mol/L NaOH调PH至7.4.，加入双蒸水定容至400ml。取200ml做固体培养基装入A瓶，200ml做液体培养基。称取3g琼脂加入A瓶。另取一小瓶，加入100ml双蒸水（配

10、氨苄）。将以上三瓶液体高压，15psi,20min。配氨苄，过滤除菌。待A、B瓶冷却至50oC，照100ug/ml浓度的氨苄，每瓶加入200ul，之后将A瓶液体倒入培养皿中，将B瓶和培养皿（倒置）贮存于4 oC。注：溶液尚未冷却时，轻轻转动，使溶解的琼脂均匀分布，应避免产生气泡。使用前1-2小时应取出贮存的平皿。细胞组织RNA提取（整个过程在冰上进行）一、 溶解细胞（1） 贴壁细胞：吸去瓶内培养液，PBS冲洗两遍，加入胰酶消化，吸去胰酶加入PBS吹打，制成细胞悬液，将悬液移入EP管，离心1000 rpm,10min，弃上清。加入Trizol 1ml。反复吹打，使沉淀溶解。（可以先加上500ul

11、吹打，再加500ul充分混匀）（2） 悬浮细胞：将细胞离心，加入Trizol反复吹打，使沉淀溶解。Trizol量为1ml/5-10X106个细胞（动植物及酵母）或1ml/1X107个细菌。（3） 组织：将组织切成小块（100mg），PBS冲洗干净，装入EP管，剪碎（非常碎，剪成组织悬液，时间可稍长些），加入上500ulTrizol吹打使组织溶解，再加500ul充分混匀。二、 水相与有机相的分离 将上述所得液体于室温放置5min以使蛋白体解离，加入氯仿(0.2ml/ml Trizol),盖上管 盖，剧烈震荡（不要用振荡器）15s，室温放置2-3min。2-8OC下离心12000rpmX15min

12、,离心后液体分三相：下层红色的酚-氯仿相，中间及上层水相。RNA全部位于水相，体积约占加入Trizol的60%。三、 沉淀RNA将水相移入新的EP管（若要是提取DNA或蛋白质保留有机相）加入异丙醇（0.5ml/ ml Trizol）,-20OC放置90min（可过夜），2-8OC离心12000rpmX10min，可见管底部凝胶状沉淀，即为RNA。四、 洗涤RNA用75%酒精（1ml/ml Trizol）冲洗沉淀，2-8OC离心7500rpmX5min,弃上清。将所得沉淀置于空气或真空（操作台内）中，干燥（注意不要过干，过干RNA难以溶解）。加入不含Rnase的水或0.5%SDS溶液溶解RNA。

13、琼脂糖凝胶电泳检测。-20OC保存。反转录RNA 3ul(量可改变) OLIGO 1ul 65OC水浴，5minH2O 5ul(量可变)冰上静置1min5Xbuffer 4ulRninhibitor 1ulDNTP 2ul 全部取好混匀后再分加M-MVLV 1ul混匀，瞬离，42OC水浴60min70OC水浴5min,终止反应PCRH2O 12.2ulBuffer 2.5ul 19.2ulDNTP 2.5ulMgCL2 2ul上游引物 0.75ul 25ul下游引物 0.75ulTAQ 0.3ulcDNA 4ul 石蜡封口，用PCR仪器，设定PCR条件。待反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测基因表达

14、。 ATF5PCR条件：94OC 5min94OC 30s55OC 30s 35cycle72OC 30s72OC 10min琼脂糖凝胶电泳1、 制胶：称取1.2g琼脂糖（跑PCR产物时胶的浓度可大些1.5-1.8g）,加入100ml 0.5X TAE，加热融化后冷却至60OC左右，加入5ulEB，混匀。倒入胶板，除去气泡。冷却30min。硬化后放入电泳槽。（用不完可用保鲜膜包好放入4OC保存）。电泳槽内加电泳缓冲液0.5X TAE，使液面高出凝胶表面1-2mm。2、 上样：取5ul样品与上样缓冲液按4：1混匀，用微量加样器小心加入凝胶样品孔内，注意勿溢出孔外。3、 电泳、紫外光检测和分析接通

15、电源，电压为5v/cm。电泳完成后，切断电源，紫外灯下观察条带。 质粒转化（操作过程需严格在无菌罩内操作）1XTSS两步转化法1、 菌种的复苏：用无菌铂丝直接挑取冻存的大肠杆菌菌株，在LB琼脂平板表面划线，（同时在ALB固体培养基划板，验证大肠杆菌，正常不生长）置37oC培养12-16小时。2、 从培养板中挑取单个菌落转到3ml LB液体培养基中，于37oC摇床震摇,培养过夜直到OD值约0.6再转入含有10mlLB（按比例1：100接）液体培养基的烧瓶中剧烈震摇4h,200rpm/min。3、 取1ml细菌培养物转移到EP管中，冰上静置10min,离心3500rpmX5min,弃上清。（注意分

16、组）4、 加入100ulTSS溶液，反复轻柔吹打以重悬菌液（打开细胞壁）。5、 加入连接产物1ul(体积不能超过10ul)，轻轻混匀后水浴40min。6、 42oC热休克90s。7、 冰浴2min，以冷却细胞。8、 于EP管中加入100ul 37预热的LB培养液，37oC震摇30min。9、 将100ul菌液均匀涂在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上。37oC培养12-16h。若所转化质粒可用a-互补筛选重组阳性克隆，则加入80ul/40ul X-Gal(20mg/ml)和8ul/4ul IPTG(20mg/ml),混匀后涂板。10、 将平板置4oC数小时后，观察培养结果（若非蓝白斑选择质粒无需

17、此步）。实验设计1、 转化时设对照组（不转染任何质粒）和转化组（转化目的质粒）2、 第9步时，对照组分别在LB固体培养基和ALB固体培养基上涂板，转化组只需用ALB固体培养基3、 预期结果：对照组在LB固体培养基生长旺盛，在ALB固体培养基上不生长；转化组在ALB固体培养基生长。质粒DNA的分离与纯化 碱裂解法小量提取质粒材料 LB液体培养基 STE溶液（0.1M NaCl，10mM Tris-HCl PH8.0，1mM EDTA） Solution I溶液（50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl PH8.0，10mM EDTA） Solution溶液（0.2M NaOH，1%SDS，现用

18、现配） Solution溶液（5M乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，H2O 28.5ml） 3M乙酸钠溶液pH 5.2、纯水、无水乙醇、70%乙醇 苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）、TE缓冲液（10mM Tris-HCl pH 7.5，1mM EDTA）方法 1、挑取含质粒的宿主菌单个菌落接种于5ml ALB液体培养基，37振荡培养20小时以上，至OD600约为0.5。 2、将1.53ml菌液转入EP管中，12000rpm离心2分钟沉淀菌斑，弃上清，倒置于吸水纸上是液体流尽。 3、加入预放置于4的STE溶液100ul重悬菌斑，12000rpm离心1分钟，弃上清，倒置于吸水纸上是液体流尽。

19、 4、加入4的100ul的Sol I重悬菌斑，必要时可振荡重悬，4放置510分钟。 5、加入200ul新鲜配制的Sol，倒置混匀510次，冰上放置23min（勿振），使细菌裂解。 6、加入150ul预置4的Sol，温和颠倒数次混匀5sec，冰上放置5min，使质粒DNA复性。然后15000rpm离心10分钟，上清入新EP管，勿吸沉淀。 7、加入等体积（约450ul）的苯酚/氯仿/异戊醇振荡混匀，15000rpm离心5min，将上层水相入新EP管，再加等体积的氯仿，振荡混匀，15000rpm离心5min，将上层水相入新EP管。 8、上清入新管，加入二倍体积的预置于20的无水乙醇，再加入原液1/1

20、0体积的3M NaAc，颠倒混匀，20放置1小时，以沉淀质粒DNA。 9、15000rpm离心10min，将上清去掉，再加入1ml 70%的乙醇，沿管壁加入，8000rpm离心10min，小心将上清弃去。 10、在空气中完全干燥后加入纯水或TE缓冲液30ul溶解沉淀，37水浴30min后放置20保存备用。质粒提取试剂的配制Solution：50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L Tris-HCL（pH8.0）；10mmol/L EDTA配制方法：200mmol/L 葡萄糖 25ml （葡萄糖 0.99085g） 0.5 mmol/L EDTA（pH8.0） 2ml 1mmol/L Tris

21、-HCL（pH8.0） 2.5ml 加ddH2O定容至100ml, 高压蒸汽灭菌15min, 贮存于4。Solution ：200mmol/L NaOH；1% SDS（现用现配）配制方法： 5mmol/L NaOH 40ul 10% SDS 100ul ddH2O 860ulSolution ：5mol/L乙酸钾 60ml；冰乙酸11.5ml；ddH2O 28.5ml；PH4.8配制方法： 乙酸钾 29.442g 冰乙酸 11.5ml 加ddH2O定容至100ml，贮存于4。STE缓冲液:10mmol/L Tris-HCL（pH8.0）； 0.1mol/L NaCL；10mmol/L EDTA

22、 （pH8.0）配制方法：NaCL 0.5844g1mmol/L Tris-HCL（pH8.0） 1ml0.5 mmol/L EDTA（pH8.0） 0.2ml加ddH2O定容至100ml, 高压蒸汽灭菌15min, 贮存于4。10% SDS（十二烷基磺酸钠） SDS 10g ddH2O 80ml 加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值为7.2，加ddH2O定容至100ml。 (注：SDS为表面活性剂，称量时要戴面罩。10% SDS无须灭菌。) 1mmol/L Tris-HCL（pH8.0） Tris 碱 12.114g 浓盐酸 5.03ml ddH2O 80ml 用浓盐酸调节溶液的pH值为8.0，补

23、ddH2O定容至100ml。0.5 mmol/L EDTA（pH8.0） EDTA- Na 18.61g ddH2O 80ml 在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值为8.0（约需2gNaOH）ddH2O 定容至100ml，高压灭菌备用。 (注：EDTA二钠盐需加NaOH将pH至调至接近8.0时才能完全溶解。)3mol/L 乙酸钠（pH5.2） 冰乙酸钠 40.81g ddH2O 80ml 用冰乙酸调节pH至5.2，ddH2O定容至100ml，高压灭菌备用。 质粒小提试剂盒（所有过程在室温下进行）E.Z.N. ATM Plasmid Mini Kit I自 备 物品：13000g转

24、离心机 无菌1.5ml离心管（4个）实验前准备：将RNaseA加入到Solution瓶中，并置于4保存。 用无水乙醇稀释DNA Wash Buffer。 使用前检查SolutionII，SolutionIII有无结晶析出，如果有将其37温育，使其溶解。1、 挑取冻存的含有质粒的大肠杆菌接种ALB固体培养基，37培养至长出单菌落。 挑取含有质粒的大肠杆菌（DH5、JM109）单克隆，接种于1-5ml的ALB中，37，300rpm活化12-16h 。2、 取1.5-5ml菌液，10000g，室温离心1min，弃上清。3、 加入250ul Solution I/RNaseA,吹打或涡旋重悬菌斑（吹打

25、至看不到固体颗粒）。4、 加入250ul Solution II，轻柔颠倒混匀数次，清洗裂解产物，可室温静置2min（管中拉丝，水膜形成）。5、 加入350ul Solution III，轻柔颠倒混匀数次，直至白色絮状沉淀生成。 6、 13000g，室温离心10min。（迅速进行下一步）7、 准备柱子，向柱内加入100-200ul BufferGPS, 10000g离心2min,去除 BufferGPS8、 将上层清夜小心加入干净的 HiBind Miniprep Column(1)将HiBind Miniprep Column(1)套入2ml收集管注意不要混入沉淀，确保没有细菌通过柱子。10

26、000g室温离心1min,使液体完全通过柱子。9、 弃滤液，重新使用离心管。向柱子中加500ul Buffer HB，10000g，室温离心1min，弃滤液，重新使用离心管。10、 向柱子中加入700ul无水乙醇稀释的DNA Wash Buffer，10000g，室温离心1min，弃滤液，重新使用离心管。11、 向柱子中加入700ul无水乙醇稀释的DNA Wash Buffer，10000g，室 温离心1min，弃滤液，重新使用离心管。12、13000g，室温离心2min，离心空柱子以除去柱子内的酒精。13、将柱子放入干净的1.5ml离心管，加入30-50ul Elution Buffer(1

27、0Mm Tris-HCl,PH8.5)或高压过的双蒸水到柱子上，室温静置1-2min, 13000g，室温离心1min，洗涤DNA，将所得DNA分装入EP管，-20保存。（可以进行第二次离心，将残余的质粒洗脱，但是浓度很低）14、用琼脂糖凝胶电泳测提取质粒大小，用紫外分光光度计检测质粒浓度。DNA浓度=A260 X 50 ug/mlMTT材料： 培养液、0.25%胰蛋白酶、MTT（5mg/ml,滤过除菌）、培养板、大、中枪和枪头、EP管、5ml离心管、细胞计数板、DMSO步骤：1、 吸掉细胞培养瓶中的旧培养液。2、 加入适量的预温PBS，轻轻晃动培养瓶，吸掉PBS。3、 加入0.25%胰酶，以

28、刚好覆盖瓶底为宜，轻轻左右摇动培养瓶。4、 镜下观察，待细胞消化变圆竖起培养瓶，吸掉胰酶。5、 加入含10%胎牛血清的1640，轻轻反复吹打，使细胞脱落形成单细胞悬液。6、 将细胞转移至EP管中，吹打混匀。7、 倒置显微镜计数。8、 调整细胞数为5104个/ml，（取部分悬液于一新的5ml离心管，家培养液）9、 转移细胞于96孔板，每孔200ul，每接一空混匀5ml管。（每种药物3块板，以得3 个平行测定结果）10、 37培养24h。（细胞进入对数生长期时开始加药）11、 换为不含血清的164012、 继续培养24h。13、 取8个新EP管，做好标记，每管加入相应量的无血清培养基14、 向EP

29、管中加药，从最高浓度到最低浓度稀释（最高浓度下多数细胞被杀死，最低浓度下不会杀死细胞，5倍一列稀释，共制备8个浓度），充分混匀。15、 取出96孔板中的细胞，以每一浓度重复3个复孔，按不同浓度做好标记。16、 吸弃孔中培养液（可倾斜平板），每孔加入200ul含有药物的培养基。17、 放入培养箱，按要求培养一定时间（SKOV3一般作用48小时）18、 药物作用结束后，取出细胞培养板，加入5mg/ml MTT（锡纸包裹的1.5ml离心管中），每孔20ul。19、 37孵育4-8h（锡箔包板），以形成蓝色甲赞结晶。20、 取出细胞培养板，小心吸掉上清。21、 每孔加入150ulDMSO，溶解MTT-

30、甲赞结晶。22、 待结晶充分混合后即可上机检测（分光光度计490nm） 调零孔（培养基、MTT、DMSO） 对照孔（细胞、药物、培养基、MTT、DMSO） 以药物浓度为横坐标（x轴）、吸光值为纵坐标（y轴），平均吸光值作为对照吸光值。 对照组吸光值减少一半时所需药物浓度为IC50浓度 试验孔吸光值/对照组吸光值100=抑制百分率 以抑制百分率为纵坐标，绘制标准曲线。 Guava Nexin Reagent标记早期凋亡细胞并描述早期凋亡与晚期凋亡细胞/死亡细胞间的差异步骤：1、 培养细胞：包括阳性和阴性对照组（适当时间诱导细胞凋亡）2、 将Guava Nexin Reagent 从冰箱取出，恢复

31、至室温3、 准备用Guava Nexin Reagent孵育的所有细胞标本，保证准备的细胞样本中至少含 1%BSA、1%FBS或10%NHS 将细胞上清和脱落细胞转移到15ml离心管中。 用胰酶消化平皿内的细胞，吸出绝大多数胰酶，加入含10%血清的1640中和胰酶，并轻柔吹打至单细胞悬液。 将平皿内的单细胞悬液移植15ml离心管内，再次吹打均匀。 1500rpm，离心10min，弃上清。 加100ul 5%1640重悬细胞并移入1.5ml EP管中（细胞浓度在2104-1105/sample或2105-1106/ml），4、 每管加入100ul Guava Nexin Reeagant （若P

32、S表达多可加125ul甚至150ul，同时减少培养液的量，100-50ul）5、 室温下避光孵育20min（锡纸包裹）6、 按Guava系统获取标本。 理想结果：左下象限：活细胞 AnnexinV-PE(-) 7-AAD(-) 右下象限：凋亡早中期细胞 AnnexinV-PE(+) 7-AAD(-) 右上象限：凋亡晚期细胞 AnnexinV-PE(+) 7-AAD(+) 左上象限：绝大多数为核碎片AnnexinV-PE(-) 7-AAD(+)无内毒素质粒大提试剂盒(室温)E.Z.N.ATM Endo-FreePlasmid Maxi Kit （6）自备物品：30005000g转离心机 无菌50

33、ml离心管（4-6个） 无水乙醇 42水浴锅 无菌吸水纸实验前准备： Buffer N3提前置于冰上。 将RNaseA加入到Solution瓶中，并置于2-8保存。 用160ml无水乙醇稀释DNA Wash Buffer。 若质粒大于10kb,70预热Elution Buffer（分装出3-4ml用5ml离心管预热）。 调节65烤箱。步骤： 细菌培养1、 挑取冻存的含有质粒的大肠杆菌接种于ALB固体培养基，37培养至长出 单菌落。 挑取含有质粒的大肠杆菌（DH5、JM109）单克隆，接种于2-5ml的ALB中，37，300rpm活化8h 。 取适量（1:500）接入200ml提前温育的ALB培

34、养基（氨苄50ug/ml），37摇床培养12-16h（OD达到1.5-2.0为好） 碱性SDS裂解2、 将培养液转入50ml离心管，30005000g，室温离心10min。3、 弃尽上清，用无菌吸水纸吸干容器的余液，加入10ml Solution I/RNaseA,吹打或涡旋重悬菌斑（吹打至看不到固体颗粒）。4、 加入10ml Solution II，轻柔颠倒混匀10-15次，清洗裂解产物，可室温静置2min（管中拉丝，水膜形成）。5、 加入5ml 冰浴的Buffer N3（沉淀菌体蛋白），轻柔颠倒混匀数次，直至白色絮状沉淀生成。（过程中室温孵育2-3min，时常颠倒混匀） 准备Lysate

35、Clearance ,将注射器活塞拔出，放到试管架上。6、 准备HiBind Maxi Column，将柱子放入50ml收集管（提取盒提供），柱内加入5ml BufferGPS，室温放置3-10min。30005000g，室温离心5min，弃洗脱液将柱子在放回50ml收集管。 Lysate Clearance Filter Syringe 清洗溶解产物7、 立即将菌液倒入Lysate Clearance Filter Syringe，静置5min（可多静置一会），白色沉淀飘到顶部（不完全到顶），用一个新的50ml离心管收集溶解产物，将活塞放回注射器筒。8、 继续将注射气筒保持在50ml离心管上

36、，缓缓推动活塞，将裂解液打入试管中，残余白色沉淀不要强制通过滤器。 ETR Solution 去除内毒素9、 加入0.1倍体积的ETR Solution（蓝色）到过滤后的溶液中，颠倒混匀7-10次，冰上静置10-20min，放置时不断颠倒（液体加入ETR后变浑浊，冰上静置后变澄清）。10、 42孵育5min ,溶液重新变浑浊，30005000g，室温离心5min，ETR在管底形成蓝色层（若ETR悬浮在溶液中，则将试管室温放置5-10min）。11、 小心地将上层水相转移到新的50ml离心管中，加入0.5倍体积的室温无水乙醇，轻柔颠倒混匀5-6次，室温孵育2min。 HiBind Maxi Co

37、lumn 纯化质粒DNA 12-18步用水平转头可提高产出率，室温离心。12、 从11步的上清溶液中取20ml加入HiBind DNA Maxi Column。柱子放在50ml离心管上，30005000g，室温离心3-5min，弃滤液，重新使用离心管。13、 重复12步直到所有清夜通过柱子，弃滤液，重新使用离心管。14、 向柱子中加入10ml Buffer HB，30005000g，室温离心3-5min，弃滤液，重新使用离心管。15、 向柱子中加入15ml无水乙醇稀释的DNA Wash Buffer，30005000g，室温离心3-5min，弃滤液，重新使用离心管。16、 向柱子中加入10ml

38、无水乙醇稀释的DNA Wash Buffer，30005000g，室温离心3-5min，弃滤液，重新使用离心管。17、 6000g，室温10-15min，离心空柱子以除去柱子内的酒精。 从 DNA Maxi Column中洗涤质粒DNA（为了快速洗涤18步可省略）18、 干燥柱子：65烤10-15min（用锡纸包住柱子）19、 将柱子放入干净的50ml离心管，加入3ml（第一次加2ml，第二次加1ml）Endotoxin-Free Elution Buffer 到柱子上，室温静置2min, 6000g，室温离心5min，洗涤DNA，将所得DNA分装入EP管，-20保存。20、 用琼脂糖凝胶电泳

39、测提取质粒大小，用紫外分光光度计检测质粒浓度。QIAGEN质粒大提提取前准备：1. RNase A加入Buffer P1,终浓度100ug/ml,2-8保存。2. 检查Buffer P2中SDS状态（低温析出），必要的话37预热。3. 4遇冷Buffer P3。准备材料:1. 标准的细菌培养物品（接种环、培养皿、摇床等）。2. 架子（垂直放置柱子。）3. 冰4. 70%酒精5. 异丙醇6. 质粒溶解液（TE，PH8.0或Tris.Cl,PH8.5）7. 1.5-2.0ml离心管8. 4离心机提取步骤：A)细菌培养、收获和裂解1.新鲜培养板中挑取单克隆于2-5ml ALB培养基，37，300rp

40、m培养8h。（使用的培养器皿体积需大于四倍的培养基体积）2.按1/500-1/1000比例接种于ALB培养基，37，300rpm培养14-16h。高拷贝质粒：取100-200ul接种于100ml ALB培养基。低拷贝质粒：取250-500ul接种于500ml ALB培养基。（使用的培养器皿体积需大于四倍的培养基体积。培养的细菌密度达到3-4X109个/ml，这样得到的菌斑重量为3g/L培养基）3.将获得的菌液4，6000g离心15min。（如果此时你想停止提取，可将菌斑冻于-20）4.加入10ml Buffer P1充分重悬菌斑。（确保使用的容器足够装下裂解液，确保使用前加入RNase A，如

41、果Buffer P1内加入LyseBlue,使用前轻柔晃动瓶身以确保LyseBlue混匀，必须确保菌斑充分混匀）5.加入10ml Buffer P2，轻柔颠倒4-6次混匀彻底，室温（15-25）孵育5min。（不能涡旋混匀，这样会使基因断裂。此时溶液变粘稠。不要使裂解反应过程超过5min。加入Buffer P2后立即扣上盖子，避免空气中的CO2使其酸化。如果Buffer P1内加入LyseBlue，那么加入Buffer P2后细菌悬液变蓝，如果悬液不变蓝或仍可见棕色斑块，则继续混匀直到显色）6.加入10ml Buffer P3，立刻轻柔颠倒4-6次彻底混匀，冰上孵育20min。（使用预冷的Bu

42、ffer P3和冰浴可以加快沉降，加入Buffer P3后可见白色絮状沉淀，沉淀中含有基因组DNA，蛋白质，细菌碎片和KDS。裂解液需彻底混匀以确保钾、硫酸盐沉淀。如果混合物依然有粘性，那么继续混匀彻底中和溶液。如果使用LyseBlue，蓝色溶液变清。）B)提取上清7.以4，不低于20000g离心30min，立刻取含有质粒的上清。（离心前，需再次混匀样品。离心需要在非玻璃器皿中进行，例如聚丙烯。离心后上清液清透。）8.以4，不低于20000g离心15min再次离心，取上清。移取120ul上清作为样品1，用于分析以确定生长和裂解的条件是否合适C)用QIAGEN-tip连接、清洗和洗提质粒DNA9

43、.向QIAGEN-tip 500中加入10mlBuffer QBT平衡柱子，通过重力使其自然流空。（QIAGEN-tip需要彻底流干，此过程不需要看守，当液面达到柱子上部时自然会停止。）10.将从第8步获取的上清移入柱子，使其自然流下通过滤膜。（上清应该立刻移入柱子。如果时间停滞过长或者因为蛋白的继续沉降使其浑浊，在放入柱子之前需要重新离心。）移取120ul滤液作为样品2. 11.用2X30ml Buffer QC冲洗柱子。（Buffer QC自然通过柱子，第一遍冲洗足以将绝大多数质粒污染物洗脱，但是当提取量大时，第二遍就非常重要。）移取240ul滤液作为样3。12.用15ml Buffer

44、QF洗脱DNA。（用15ml或50ml离心管收集洗脱液。不推荐使用聚碳酸酯离心管，因为不能耐受后续步骤使用的酒精。注：如果产物大于45-50Kb，65预热洗脱Buffer有助于提高产量。） 移取120ul滤液作为样品4，用于分析。D)沉淀、清洗、溶解DNA13.加入10.5ml（0.7倍体积）室温异丙醇到洗脱液中沉淀DNA。立刻混匀，4，不低于15000g离心30min。小心弃上清。（一次性锥形底离心管可以选择4，5000g离心60min。异丙醇沉淀具有玻璃外观，比酒精沉淀的絮状含盐沉淀难发现。异丙醇沉淀贴壁不牢，弃上清时要非常小心。）14.加入5ml室温70%酒精，不低于15000g离心10

45、min。小心弃上清避免碰到沉淀。（一次性锥形底离心管可以选择4，5000g离心60min。70%酒精用来洗脱沉淀的盐，并且挥发的乙醇可以移走残余的异丙醇，是DNA提取更容易。）15.空气中干燥沉淀5-10min,用合适体积的质粒溶解液（TE，PH8.0或Tris.Cl,PH8.5）溶解DNA。（溶解DNA时清洗侧壁，充分收集，特别是使用玻璃器皿时。应避免使用移液器反复吹打促进DNA混匀，这可能会导致DNA断裂。沉淀过于干燥会导致DNA难以溶解。DNA溶液最好保存在微碱性环境中，酸性Buffer难以溶解DNA。）质粒小提试剂盒（所有过程在室温下进行）E.Z.N. ATM Plasmid Mini

46、 Kit I自 备 物品：13000g转离心机 无菌1.5ml离心管（4个）实验前准备：将RNaseA加入到Solution瓶中，并置于4保存。 用无水乙醇稀释DNA Wash Buffer。 使用前检查SolutionII，SolutionIII有无结晶析出，如果有将其37温育，使其溶解。1、 挑取冻存的含有质粒的大肠杆菌接种ALB固体培养基，37培养至长出单菌落。 挑取含有质粒的大肠杆菌（DH5、JM109）单克隆，接种于1-5ml的ALB中，37，300rpm活化12-16h 。2、 取1.5-5ml菌液，10000g，室温离心1min，弃上清。3、 加入250ul Solution I

47、/RNaseA,吹打或涡旋重悬菌斑（吹打至看不到固体 颗粒）。4、 加入250ul Solution II，轻柔颠倒混匀数次，清洗裂解产物，可室温静置2min（管中拉丝，水膜形成）。5、 加入350ul Solution III，轻柔颠倒混匀数次，直至白色絮状沉淀生成。 6、 13000g，室温离心10min。（迅速进行下一步） （柱子使用前加100-200ul Buffer GPS，室温10000g 离心2min,去除GPS）7、 将上层清夜小心加入干净的 HiBind Miniprep Column(1)将HiBind Miniprep Column(1)套入2ml收集管注意不要混入沉淀，

48、确保没有细菌通过柱子。10000g室温离心1min,使液体完全通过柱子。8、 弃滤液，重新使用离心管。向柱子中加500ul Buffer HB，10000g，室温离心1min，弃滤液，重新使用离心管。9、 向柱子中加入700ul无水乙醇稀释的DNA Wash Buffer，10000g，室温离心1min，弃滤液，重新使用离心管。10、 向柱子中加入700ul无水乙醇稀释的DNA Wash Buffer，10000g，室温离心1min，弃滤液，重新使用离心管。11、 13000g，室温离心2min，离心空柱子以除去柱子内的酒精。12、 将柱子放入干净的1.5ml离心管，加入30-50ul Elu

49、tion Buffer(10Mm Tris-HCl,PH8.5)或高压过的双蒸水到柱子上，室温静置1-2min, 13000g，室温离心1min，洗涤DNA，将所得DNA分装入EP管，-20保存。（可以进行第二次离心，将残余的质粒洗脱，但是浓度很低）13、 用琼脂糖凝胶电泳测提取质粒大小，用紫外分光光度计检测质粒浓度。14、 DNA浓度=A260 X 50 ug/mlWestern blot的原理、操作及注意事项原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种

50、特点，可检测到低至15ng（最低可到10100pg）中等大小的靶蛋白。 一、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织： 组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0研磨，加入5STOP buffer，180W，6mins，0超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20保存，用时取出，直接溶解上样。2 细胞：细胞的处理方法： 离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5STOP buffer，收集，180W，6mins，0超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入

51、-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20保存，用时取出，直接溶解上样。3 分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入-ME、溴酚蓝制样。B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因1.双缩脲法：双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L10g/L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。2.Lowry法：此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu+与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂