细胞增殖调控与癌细胞

1、第十四章 细胞增殖调控与癌细胞,检验点（checkpoint,在细胞周期中，决定细胞周期能否继续向前运转的某一特定时期，称为检验点,细胞周期检验点是细胞周期调控的一种机制, 主要是确保周期每一时相事件的有序、全部完成并与外界环境因素相联系,G1/S检验点 ：启动DNA的复制,S期检验点：检验DNA复制是否完毕,G2/M检验点：能否开始分裂,中-后期检验点：纺锤体组装的检验,细胞周期中的主要的检验点,1、MPF的发现及其作用 成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF）, 又称有丝分裂因子(Mitosis-promoting factor), 早期称为M期促进因

2、子(M-phase promoting factor, MPF)，是指M期细胞中存在的促进细胞分裂的因子,1970年，Johnson and Rao将同化的不同细胞周期的细胞诱导融合 早熟染色体凝集（染色体超前凝集）(Premature chromosome condensation,PCC)超前凝集染色体,卵细胞细胞质移植实验,2、MPF与 CDK激酶 (周期蛋白依赖性蛋白激酶) (1) MPF的构成 1988年， Maller实验室的Lohka将非洲爪蟾的MPF纯化。由两个不同的亚基组成的异质二聚体: p32和p45(非洲爪蟾)，使蛋白质底物磷酸化。 1983年 Tim Hunt发现海胆的

3、卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期振荡，命名为周期蛋白(cyclin A和B)。后来发现各类动物来源的细胞周期蛋白mRNA均能诱导蛙卵的成熟,MPF：cyclin-Cdk 周期蛋白称为调节亚基 催化亚基从ATP上转移磷酸到丝氨酸和苏氨酸残基上,催化亚基 是丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶 其活性有赖于周期蛋白，故该蛋白称为周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent protein kinases,Cdks); 调节亚基：周期蛋白(cyclin,1960s Leland Hartwell,1970s Paul Nurse 分别以芽殖酵母和裂殖酵母为实验材料，利用温度敏感突变株，发现许多与细胞

4、分裂有关的基因(cell division cycle gene, cdc基因)。 裂殖酵母cdc2、芽殖酵母cdc28突变型在限制温度下无法分裂； cdc2和cdc28都编码一个34KD的蛋白激酶，促进细胞周期的进行。 MPF=p34cdc2(p34cdc28)+ p56cdc13 (cyclinB) weel和cdc25分别表现为抑制和促进CDC2的活性。 wee1突变型则提早分裂，cdc25突变型细胞体积增大而不分裂,Cdc 25 M期: A, B,含有周期蛋白框：介导与不同CDK结合,含有破坏框：将泛素（遍在蛋白）连接到破坏框上,cell cycle regulation,4、细胞周期

5、运转调控,1）G2/M期转化与CDK1激酶的关键性调控作用 M期CDK1（p34cdc2）的激活起始于分裂期cyclinB的积累。 结合cyclin B的CDK1被Wee1/mik1激酶将Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性，使CDK1/cyclin B不断积累。 在M期，Wee1/mik1激酶的活性下降，在蛋白水解磷酸酶cdc25c使CDK1的Thr14和Tyr15去磷酸化，去除了CDK1活化的障碍。 CDK1的激活需要Thr161的磷酸化，它是在CDK活化激酶(CDK1 activating kinase CAK)的作用下完成的,CDK activating,G2/M期转化与CDK1激

6、酶的关键性调控作用,CDK1的调节与活化; CAK=CDK1-Activiting Kinase,2）M期周期蛋白与细胞分裂中期向后期转换,在中期当MPF活性达到最高时，激活后期促进因子复合体 (Anaphase Promoting Complex，APC)将泛素连接在cyclinB上，cyclinB被蛋白酶体(proteasome)降解，完成一个细胞周期。 分裂期周期蛋白N端有一段序列与其降解有关，称降解盒(destruction box)。 泛素由76个氨基酸组成，高度保守。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。 26S蛋白酶体是一个

7、大型的蛋白酶，可将泛素化的蛋白质分解成短肽,APC活性调节：两类 正调控因子：cdc20/Fizzy, cdh1/Fzy等 负调控因子：Emi1, Emi2, Mad2, BubR1等,APC种类：15种，如cdc16, cdc23, cdc27和BimE等,泛素与周期蛋白的降解：多聚泛素化作用(polyubiquitination) 泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme, E1) 泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme, E2) 泛素连接酶(ubiquitin ligase, E3,APC的活性调节控制周期蛋白B的降解 当MPF的活

8、性在有丝分裂中期达到最高峰时, 它被CDK所激活，即APC磷酸化后被激活； 接着发生周期蛋白B遍在蛋白多聚化, 引起周期蛋白B的降解； 由于周期蛋白B是MPF的一个必需亚基, 它的降解势必导致MPF的失活； 在G1期的后期,APC失活,使得周期蛋白B的浓度升高,同时提高MPF的活性, 以便进入下一个有丝分裂期,3）G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性CDK,G1期，在生长因子的刺激下，cyclin D表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb蛋白（成视网膜细胞瘤蛋白）磷酸化而失活，释放出转录因子E2F，促进许多基因的转录，如编码cyclinE、A和CDK1的基因。 在G1-S期，c

9、yclinE与CDK2结合，促进细胞进由G1期向S期转化，并直接参与中心体复制与调控。TGF抑制cyclinE-CDK2的活性使细胞抑制在G1期。CyclinE的抗体能使细胞停滞于G1期。CDK2催化p107磷酸化，释放E2F。 在S期，cyclinA与CDK2结合为S期的主要激酶，参与DNA复制，使复制因子RF-A磷酸化而活性增强,G1期周期蛋白降解通过SCF（Skp-cullin-F-box protein）泛素化途径实现。 G1期周期蛋白不含破坏框序列，而含PEST序列，对G1期周期蛋白降解起促进作用。 参与复制的调控因子，如p21, p27和p57等通过泛素化途径降解。 SCF具有E3

10、泛素连接酶的功能，由Skp1, Cul1和Rbx1三种亚基构成。 SCF的底物特异性由F-box蛋白决定,DNA复制活动调控 复制起始点识别复合物：6个亚基，ORC1-6 cdc6 和cdc45也是复制所必需的 “DNA复制执照因子学说”：存在于细胞质中，随细胞分裂进行，“执照”信号与减弱直到消失。 DNA复制执照因子的本质为Mcm蛋白，分为6种,4） S/G2/M期转换与DNA复制检验点,包括S期内部检验点和DNA复制检验点。 S期内部检验点通过染色体结构维持蛋白SMC1磷酸化实现（ATM-MDC1-MRNC等中介物的系列催化过种实现），或通过ATM/ATR介导的cdc25A磷酸酶过磷酸化而

11、降解。 复制检验点由ATR/CHK1激活实现。 ATR/CHK1介导cdc25A降解，抑制cyclin E/A-CDK2通路,DNA damage checkpoint: Cell-cycle progression is blocked by DNA damage and p53,How DNA damage arrests the cell cycle in G1,有两个这样的限制点: 1.一个在晚G1期: 阻止进入期; 2.一个在晚G2期: 阻止进入期; P53: 基因调控蛋白.DNA破坏通过间接机制激活p53。 Mdm2 作为ubiquitin ligase起作用，导致p53用于蛋白酶

12、体（proteasomes）引发的降解. P53磷酸化降低了对Mdm2的连接. P21(CKI protein) 结合到 G1/S-Cdk和S-Cdk，抑制其活性，因而 阻断了期进入期,Current model for regulation of the eukaryotic cell cycle,第二节 癌细胞,癌症是一种严重威胁人类生命安全的疾病。动物体内细胞分裂调节失控而无限增殖的细胞称为肿瘤细胞(tumor cell)。 良性肿瘤：生长缓慢，与周围组织边界明显。 恶性肿瘤：癌症(cancer)，生长快、具有迁移性。 单一细胞癌变就会形成癌症,一癌细胞的基本特征,癌细胞有三个显著的基本

13、特征即：不死性，迁移性和失去接触抑制。 不死性，迁移性，失去接触抑制，生长信号的自给自足，对程序性细胞死亡的逃逸，增长血管的能力。最新研究表明，肿瘤还具备第七种特征：肿瘤相关性炎症。 如何判别？癌细胞还有许多不同于正常细胞的形态特征和生理、生化特征,1、癌细胞的形态特征,癌细胞大小形态不一，通常比它的源细胞体积要大，核质比显著高于正常细胞。 出现巨核、双核或多核现象。核内染色体呈非整倍态（aneuploidy），某些染色体缺失，而有些染色体数目增加。 线粒体表现为不同的多型性、肿胀、增生。 细胞骨架紊乱，某些成分减少，骨架组装不正常。 细胞表面特征改变，产生肿瘤相关抗原（tumor assoc

14、iated antigen,染色体非整倍性,2、癌细胞的生理、生化特征,1）细胞周期失控，生长和分裂失控； 具有无限增殖能力，成为“永生”细胞。 2）具有扩散性（迁移性）； 癌细胞的细胞间粘着性下降，具有侵润性和扩散性，这是癌细胞区别于良性肿瘤细胞的主要特征。 在分化程度上癌细胞低于良性肿瘤细胞(一定程度的去分化)，且失去了许多原组织细胞的结构和功能,扩散性,癌细胞的迁移,体外培养的恶性转化细胞,3）细胞间相互作用改变； 识别改变；表达水解酶类；产生新的表面抗原。 4）表达谱改变或蛋白活性改变； 往往有胚胎细胞蛋白表达，胎儿甲种球蛋白（甲胎蛋白）是胎儿所特有的。但在肝癌细胞中表达，因此可做肝癌

15、早期检定的标志特征。 端粒酶活性升高； 纤连蛋白减少； 蛋白质合成及分解代谢都增强， 5）体外培养的恶性转化细胞特征,体外培养的恶性转化细胞的特征,恶性转化细胞同癌细胞一样具有无限增殖的潜能； 在体外培养时贴壁性下降； 失去接触抑制； 培养时对血清依赖性降低； 当将恶性转化细胞注入易感动物体内，往往会形成肿瘤,二、癌基因与抑癌基因肿瘤形成的内因,涉及到两大类与细胞增殖相关的基因的突变： 促进细胞增殖相关基因突变：原癌基因(proto-oncogene)突变形成癌基因(oncogene) 抑制细胞增殖相关基因突变：肿瘤抑制基因(tumor-suppressor gene)，抑癌基因 细胞癌变是基

16、因突变累积和自然选择的结果，所以患者多为年长者。 原癌基因与肿瘤抑制基因产物协调作用，避免细胞癌变,1、癌基因( oncogenes,癌基因 oncogenes, onc ：可引起细胞癌变的基因，是调控细胞增殖、分裂和生长的正常基因（原癌基因）的突变形式。 原癌基因proto-oncogenes：细胞中调控细胞增殖、分裂和生长的一类正常基因（促进因子），当其突变会促进癌症的发生（即变成癌基因）。 癌基因按其来源可分为两类： 细胞癌基因(原癌基因突变而来): c-onc ; 病毒癌基因(致肿瘤病毒中携带): v-onc,研究历史 早在1911年Rous发现鸡肉瘤无细胞滤液能引起鸡产生新的肉瘤，几

17、十年后，他证实了病原体为劳氏肉瘤病毒（Rouss sarcoma virus, RSV），为此获得1966年的诺贝尔奖（是年Rous已87岁）。 1970年Temin 和Batimore证实RSV是反转录病毒，获1975年诺贝尔奖。 1970s H. Varmus和J. M. Bishop发现RSV中的致瘤基因是src，编码一种胞质酪氨酸激酶，参与细胞增殖相关的信号转导。 用src的cDNA（complementary DNA）和其他基因组DNA杂交，发现src的同源物普遍存在于动物细胞（如鸡、鸭、果蝇）。原来src编码一种胞质酪氨酸激酶，参与细胞增殖相关的信号转导，是细胞的正常组分,原癌基因

18、的产物主要包括： 生长因子，如sis； 生长因子受体，如fms（受体酪氨酸激酶，CSF-1 受体）、erbB（受体酪氨酸激酶，EGF 受体）； 信号转导组分，如src、ras、raf； 细胞周期蛋白，如cyclin D； 细胞凋亡调控因子，如bcl-2； 转录因子，如myc、fos、jun,原癌基因编码蛋白,原癌基因激活往往是显性突变两个等位基因中的一个激活即会致肿瘤,Ras oncogene: Retain bind GTP,Bcl-2 oncogene: Prevent apoptosis,2、抑癌基因(Tumor-suppressor genes,抑癌基因是正常细胞增殖过程中的负调控因子

19、，其产物抑制细胞增殖；促进细胞分化；和抑制细胞迁移。 通常发生于功能丧失性突变(隐性突变,抑癌基因失活往往是隐性突变两个等位基因都失活时才会致肿瘤,抑癌基因的种类,转录调节因子（控制细胞周期或诱导细胞凋亡）：如Rb、p53。Rb基因突变导致视网膜母细胞瘤形成；P53基因突变将导致细胞癌变或凋亡。 负调控转录因子：如WT； 周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CDKI），如p21； rasGTP酶活化蛋白(GAP)：如NF-1； DNA修复因子：如BRCA1、BRCA2； 磷酸脂酶： 如PTEN； 细胞粘附分子： 如DCC,Rb基因突变导致视网膜母细胞瘤形成,Rb作用机理： 其产物成视网膜瘤蛋白（pRb

20、）是转录因子E2F的抑制因子； G1期CDK激活后将pRb磷酸化，从而解除它对E2F的抑制； 相关基因表达，细胞周期由G1向S期运转,Rb基因最早发现的抑癌基因,P53基因突变将导致细胞癌变或凋亡,p53作用机理： p53基因产物（p53蛋白）在G1期检查DNA损伤； 如有损伤，就暂停周期运转，待损伤DNA修复后继续； 如修复失败， P53蛋白引发细胞凋亡,三、致癌因素肿瘤形成的外因,1、生物性因素 2、物理因素 3、化学致癌物,1、生物性因素,肿瘤病毒：逆转录病毒、乙型肝炎病毒（HBV）、人乳头瘤状病毒（HPV）等 霉菌：目前已知有数十种霉菌毒素对动物有致癌性。 如黄曲霉毒素（aflatoxin）, 是一类杂环化合物，其中黄曲霉毒素B1是已知最强的化学致癌物之一，可引起肝癌,2、物理因素,电离辐射； 紫外线，可引起细胞DNA断裂、交联和染色体畸变，抑制皮肤的免疫功能，诱发皮肤癌、基底细胞癌和黑色素瘤,3、化学致癌物,亚硝胺类，能引起消化系统肿瘤； 多环芳香烃类，如苯并芘。 芳香胺类，如乙萘胺、诱发泌尿