凝胶层析操作过程(莫雯静)

1、凝胶层析操作过程,凝胶层析即凝胶过滤技术,凝胶过滤技术主要包括： （1）层析介质的选择 （2）凝胶粒度的选择 （3）凝胶用量的计算 （4）凝胶的处理 （5）柱的选择 （6）装柱 （7）流动相的选择 （8）样液的制备 （9）上柱 （10)洗脱 (11)凝胶柱的再生与保存,凝胶层析操作过程主要可分为三大步骤,装柱 上柱 洗脱 凝胶层析实验操作过程,一）层 析 柱 的 选 择,层析柱是所有层析方法的主要主要组成 部分。对层析柱选择合理与否将直接影响分离效果。 选择层析柱主要考虑被分离组分相对分子质量的差异：（1）分离相对分子质量差别较大的样品可采用短粗的层析柱，柱长度：柱内径=10:1或20:1，如

2、脱盐柱。 （2）分离相对分子质量差别较小的样品，可采用细长的层析柱，柱长度：柱内径=50:1,或100:1如：蛋白质组分分离,层 析 柱 简 介,层析柱简介,1、普通层析柱 2、中压柱 3、尼龙膜,层析柱简介,层析柱是凝胶层析技术的主体：工厂中的层析柱,层 析 柱 简 介,低压凝胶层析柱,二）装 柱,装柱的方法可分为湿装法和干装法两种 湿装法：加适量溶剂到柱内 排走空气 搅匀预先用溶剂浸泡好的吸附剂 将此悬浮 连续倒入柱中 自然沉降（至柱高1/41/3) 打开柱的下端口 溶剂流出，柱上端悬浮液下降至所需高度 干装法：直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂。 （湿装法对各种基质都适用,装柱应注意事项,

3、在装柱前要在柱的底部放置一层玻璃纤维或者棉花。 层析柱中基质应符合填装均匀，一致和没有松紧气泡的标准，所以装柱时， 吸附剂表面要平整，应使其一直浸泡在溶剂的中，防止气泡或裂纹产生,三）流动相的选择,在选择凝胶过滤所使用的缓冲液主要考虑三方面因素： （1）被分离物质的稳定性： 包括缓冲液的ph、离子强度及保护剂。 （2）凝胶介质的稳定性：要求不与介质发生化学反应，不变形，不降解。 （3）分离物质后处理：被分离组分经凝胶过滤分离后如还需采用其他方法进一步分离，该采用与后续层析方法同一缓冲液。如果后处理是冰冻干燥，可选用易挥发性的溶液， 如hac和nh4oh,四）样 液 的 制 备,样品在上样前要进

4、行适当的处理，如通过离心、沉淀、抽提等方法以去除杂质，样液的浓度不宜太稀也不宜太浓，组分不宜太多,五）上 柱,上柱是将欲分离的混合液加入凝胶层析柱的过程，要在洗脱液的液面恰好与凝胶床的表面相平时加入混合液，使组分能够均匀的进入凝胶床。上柱的混合体积常为凝胶床体积的10%左右，最大不能超过30%。混合液的浓度可以高些，但是黏度宜低,六）洗 脱,样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面洽与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液洗管壁，洗脱液应与干燥凝胶溶胀时及装柱平衡时所使用的液体完全一致，否则会影响分离效果。使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速。一般来

5、说，洗脱流速慢，分离效果好，但是太慢也会因扩散加剧而影响分离效果。另外洗脱时的流速要严格控制，否则收集的每一部分洗脱体积就不会恒定，理想的分配技术就难以测出。控制流速的最好装置是恒流泵,流速对洗脱曲线峰形的影响,洗脱剂的流速对分离效果也有很大的影响，下图显示了同一凝胶柱在不同流速下的洗脱曲线，可见在较快的流速下得到的洗脱峰较宽且低，流速低洗脱峰窄而高。也就是说流速较低，分辨率较高,恒流泵,欲达到流速恒定的目的，可自己恒压加液装置（下图），更可靠的是使用微量恒流泵,如果没有恒流泵该怎么办,没有恒流泵的情况下可用控制操作压的办法。其操作压是通过两个液面之间的距离来控制的,流速与操作压关系,洗脱时，流速与操作压有关，与凝胶的型号与粒度也有关，在同样的操作压下，洗脱时往往编号小的葡聚糖凝胶，以及颗粒粗的凝胶流速大；编号大的，粒度细的流速慢。对于某种凝胶来说，在一定范围内，操作压加大，流速加快。对于强度大的凝胶，如sephadex g1050，在相当大的柱压范围内流速(v)与操作压（f)成正比，与柱长(l)成反比： v=k p/l 但是对于强度差的凝