士别三日看HPLC填料中的表面多孔颗粒.doc

1、 士别三日，看HPLC填料中的表面多孔颗粒 从上世纪60年代发展起来的HPLC填料算起，表面多孔颗粒（superficially porous particle，以下简称SPP）已有40多年的历史了。但是在最近，这种拥有坚固粒核和表面薄层多孔结构的填料又重新获得长足发展-粒径低于3m（sub-3 m，以下简称亚-3m）的表面多孔颗粒相比起粒径低于2m（sub-2 m，以下简称亚-2m）的全多孔颗粒，具有更好的柱效，但是压降只有后者的一半。这次“色谱柱观察”专栏就是要跟踪报道SPP相关产品（近来一般被称作核壳core shell 、熔融核心 fused core 、多孔外壳porous shel

2、l填料）是如何在与之前超高压液相（ultrahigh-pressure liquid chromatography，以下简称UHPLC）相关产品的竞争中士别三日，颖脱而出，并应用于大、小分子分离的。 在传统的液相色谱与高效液相色谱（high performance liquid chromatography，以下简称HPLC）中，全多孔填料诸如硅胶、氧化铝、离子交换树脂被广泛应用。这些填料所以行之有效，关键在于它们有高的表面积、样品容量、不错的保留时间，而且还能键合不同的有机官能团。 在上世纪60年代早期，我们现在所认识的HPLC在那时还没出现。研究人员虽然从理论上预言液相色谱能变得更加高效，

3、但是并没有多少实际工作去证明这点。彼时，大部分的色谱工作者使用粒径超过100m的多孔颗粒做填料，开口玻璃柱做色谱柱。这些填料主要是通过用不同孔径的筛网过滤不规则颗粒分类得来的。色谱工作者利用液体自身的重力来使流动相通过玻璃柱，在柱子出口收集目标物，再把收集到的流出物进行离线分析，比如紫外-可见光光谱分析。用今天的标准来看，这些色谱图的峰型是非常难看的。即使通过加压提高流动相的速度，也只能得到更加宽的峰型，因为被测物在这些多孔填料中的吸附、解吸太慢了。为此必须做些事去提高色谱分离的速度，比如降低填料上微孔的深度、缩短物质的迁移路径，又或者提高物质的迁移速率。早期的SPPs Purnell,Gol

4、ay和Knox三人的理论还有气相色谱上的实践经验催生了Horvath教授的论文，其预言使用坚硬物质做核心，粒核外面再覆盖一层薄薄的多孔固体作为固定相能提高物质的迁移速率。Horvath与其同事最先发布这种叫多孔层珠（porous layer bead ，简称PLB，可以看作其是有一层薄膜或表面多孔的颗粒，即SPP）的填料，并把它用于核苷酸的离子交换色谱分离。这种SPP填料以玻璃作为颗粒的核心，外面覆盖着一层薄薄的聚苯乙烯-二乙烯苯聚合树脂，树脂上再键合阴离子交换官能团。图1展示了其与之前的大孔颗粒的不同。图1a是早期使用的典型大多孔颗粒。当物质进入柱子，其会扩散到这些颗粒的孔中（流经柱子的过程

5、其实就是上百万次反复吸附、解吸的过程），由于进出粘滞流动相时的扩散速度慢，这需要耗去相当长的时间，也就是说物质需要很长的时间才能被洗出。缓慢的物质迁移速率是色谱图中峰型变宽的原因。当然，通过提高色谱柱的使用温度可以降低流动相的粘度，但是这只能带来小许的改善而且在当时也显得不大方便使用。图1b展示了SPP的原理。直径40m 图1 的球形玻璃珠被用作基体，球体的外面覆盖了一层薄薄的离子交换树脂、硅胶或者表面孔隙度控制在某个范围的小珠（controlled surface porosity beads）。这外层一般有12m厚。当物质进入色谱柱，扩散到SPP颗粒填料中时，其扩散路径由此被限制在一个较窄

6、的范围内。通过缩短填料中的孔隙深度，SPP填料缩短了物质在粘滞流动相中的扩散路径。这时扩散只能在填料的表面薄层上进行，物质在两相间的迁移速率就会大大提高。从这里我们可以看到，表面薄层越薄，物质迁移速率越高，柱效就会越好。当然，表面薄层变薄，容量因子（capacity factor，表现为柱子的柱保留 retention）与样品容量(sample loading)就会变低。因此需要在薄层厚度与容量之间取得平衡点。 相比早期LC用到的大孔颗粒，SPPs填料能使得分离速度更快（只需2030min，而前者往往需要几小时），分离效果更好（理论塔板高度为12mm），检测灵敏度更高。用户通过简单的机械振动，

7、就能把SPPs填料干法装填到50cm与1m的不锈钢柱子内。许多化学基团被尝试键合到薄层上，用于不同的色谱分离，比如正相、反相、离子交换色谱。在70年代早期，许多色谱分离方法的成功开发正是得益于SPP柱子的应用。 60年代末70年代初 SPPs填料的商业化，以及在线紫外检测器的出现大大促进了HPLC的发展。但是，稍后出现的微型全多孔硅胶颗粒在大小、装填上取得的突破性进展，柱效由此得到很大的提高，这也导致了早期的SPPs填料慢慢变得销声匿迹。图1c展示的微型全多孔填料改善了物质的迁移，从而使得柱效提高了至少一个数量级。除此以外，更小的多孔颗粒也预示着更大的表面积，这使得其能比SPPs填料容纳更多的

8、样品量。这些填料也能用于制备色谱以及为取得更好的检出限而采用的大进样模式。 在之后的几十年中，虽然为了解决某些特殊的分离任务，有一些新的SPPs填料得以再现，但不得不承认，70年代曾大行其道的SPPs填料已从80年代初开始让位给了微型全多孔填料，其应用也只限于一些验证过的旧方法或者保护柱中易于装填的填料。 现代的SPPs 对比直径40m的前辈，现在的SPPs填料明显苗条多了-直径5.0m，薄层厚度0.25m，孔径300。颗粒的核心由玻璃珠变成坚固的二氧化硅，在其上面覆盖的是一层薄薄的纳米颗粒。这种SPP色谱柱被推荐用于生物大分子，比如蛋白质的快速分离。生物大分子的扩散系数大约只有普通小分子的1

9、/10。SPP填料上的薄层能使得这些扩散缓慢的蛋白子分子 图2只能在较窄的范围内渗透（坚硬的核心阻止了其继续往前扩散）。对比同样大小的全多孔颗粒，SPP具有较快的物质迁移速率，同时能在不损失太多柱效的前提下使用较高的流速。在图2a与图2b中，展示了5m粒径的全多孔填料与5m的SPP填料。对于前者，假设物质分子扩散到颗粒的中心位置，然后再返回，整个迁移路径约为5m（进出分别为2.5m）。由于生物大分子的迁移是十分缓慢的，这会导致峰型的变宽，这在需要提高流速的快速分离上就显得更加明显。 图2b是同样粒径的SPP填料，由于蛋白质分子只需在颗粒外面的薄层进行扩散，其整个迁移路径只有0.5m（进出分别为

10、0.25m）。这距离只有前面全多孔颗粒的1/10，所以扩散的时间大大缩短，峰型变得更尖锐。即使是在高流速下，峰宽仍然比全多孔颗粒的填料窄。 从图3a、b的色谱图比较可以看出两者的区别。这里分别对一组蛋白质：lysozyme与myoglobin在752.1mm色谱柱中进行高流速色谱分离。图3a用的是大孔径（300 ）的全多孔硅胶填料，图3b所用的是大孔径（300 ）的SPPs填料。对于蛋白质的分离，一般采用梯度分离。因为如果使用等度分离，采用不同填料造成的柱效差异会更大。在梯度分离时，SPP填料的柱子由于具有更快的物质迁移速率，所以峰型比全多孔 图3 填料的柱子明显尖锐。在SPP填料的柱柱温：7

11、0，波长：210nm:峰1: lysozyme, 峰2： myoglobin. 子分离中，我们能轻易观察到蛋白质 lysozyme ，即峰1前面有一个不完全分离的杂质峰。这里，我们把两种不同填料的柱子对应的谱图在不同流速下做了平行比较。同时，当流速提高，两者的保留时间皆有缩短，梯度时间也不得不做相应调整。 为了更好描述SPP填料的分离效率，图4展示了八种蛋白质在2.1mm直径柱子中的快速梯度分离，这过程不过仅仅耗时0.75min。 图4粒径低于3m的SPP 之前我们已经提及孔径为300 的SPP填料适用于大分子的快速分离。而近来亚-2m（1.51.9m）填料的发展也使得小分子的快速分离得以实现

12、。现在，装填了亚-2m填料的50mm短柱，其分离时间已少于1min，同时较长的柱子（大于150mm）也已具有几万多的理论塔板数。然而由于采用粒径小的填料会造成柱压增大，有时须用上超高压液相色谱UHPLC。 最近，SPPs再次得到人们的重视。新型的SPPs雨后春笋般出现，名称花样百出，有些叫什么熔核的，也有些叫什么核壳的。这些填料颗粒直径为2.62.7m，外层的多孔层厚度为0.5m，孔径90120 ，适合进行小分子的分离。相对亚-2m的SPPs填料，此类较高粒径的填料能提供较低的柱子压降（比前者降低4060%），然而仍然拥有较短的扩散路径等其他小粒径填料的优点。通过特殊的合成工艺，我们能控制SP

13、P的微粒粒径在一个很窄的范围内，这范围远比制作全多孔填料微粒时要窄。这样，均匀的填料能更有效率地装填到色谱柱中，这能使得范第姆特方程方程（）式中的参数A（涡流扩散项）降低。除此以外，也有研究证明参数B也会因此降低。通过同时降低范第姆特方程方程式中的三个参数，这些用粒径为2.62.7m的SPP装填的柱子，其柱效能媲美之前亚-2m的SPP柱。在较低的压 降下实现高柱效，这样用户们就能继续使用他们原 来的LC系统，而不必升级到UHPLC了。 图5 另一方面，利用UHPLC系统也使得我们能通过使用更长的SPP柱子，从而获得更大的理论塔板数。图6对比了分别使用SPPs填料与亚-2m全多孔填料进行高柱效分

14、离的情况。现在大部分的对比试验都倾向用较短的色谱柱进行高通量应用，耗时一般只有几分钟。而图6所示的对比试验却是用装填上述两种不同填料的长柱进行的，两根柱子都有超过10万的理论踏板数，尺寸皆为55cm2.1mm。可以说它们具有基本相同的塔板数和分离时间。对比后能发现，两者最大的不同来自柱压的差别。对于亚-2m的全多孔填料，柱压已经超过1000bar(15000psi)，然而粒径2.7m的SPP填料，柱压只有547bar(8200psi)。图5 范第姆特方程方程已经商业化的现代SPP柱子到目前为止，只有少数几家公司能提供SPP柱子用于大分子和小分子的分析（见下表）。菲罗门公司除了提供2.6m粒径的

15、SPP填料，还推出了1.7m粒径规格的填料，对比亚-2m的全多孔填料，该种填料在相同的压降下，能得到更好的分离效率，这对之前容易因为柱外效应出现峰型变宽的UHPLC系统来说，的确是一个大的挑战。由于SPPs能用于HPLC与UHPLC系统，所以可以预料在未来会有更多其他的公司推出此 类产品。另外，针对亚-3m的SPPs填料，越来越多的固定相也正在研发当中，相信在不久的将来，其固定相的种类能与亚-2m或常规的HPLC全多孔填料相当。 结论 SPP的概念在液相色谱中出现已有相当时间，如今以全新面目粉墨登场后，俨然已经成为亚-2m全多孔填料的强劲对手。最新的SPP产品不仅能为大分子也能为小分子提供快速分离，特别是进行小分子分离时，其压降比亚-2m的全多孔填料产品要低许多。虽然本文不在此做深入讨论，但相对亚-2m全多孔填料，用于分离小分子的SPPs具有较厚的微粒薄层，这样其样品容量不会像早期的大粒径SPPs填料那样发生很大的下降。相对亚-2m全多孔填料，SPPs填料的可用表面积只下降了25%，然而由于SPPs颗粒的填充密度高，相同规格的柱子里，SPP拥有的固定相基团数量基本与前者相当的。因此，上述两种不同类型柱子的样品容量其实也是差不多的。无论是用于小分子分析的2.62.7m 粒径的SPP柱子，还是用于大分子分析的5m粒径的SPP柱子，其进出口都采用2.