对心脏成纤维细胞是否在表型上具有多样性的研究

1、对心脏成纤维细胞是否在表型上具有多样性的研究摘要：目的 探讨心脏成纤维细胞 （CFs） 生物表型多样性。方法 新生13天SD大鼠12只， 胰蛋白酶/胶原酶联合消化法分离培养新60只生大鼠CFs, 比较原代和传代培养细胞形态学变化， 免疫组织化学学检测鉴定常见成纤维细胞标记波形蛋白 （vimentin） 、成纤维细胞特异性蛋白1 （FSP1） 和盘状结构域受体 （DDR2） 的表达， 细胞免疫荧光检测CFs干细胞标记nanog、c-kit、sca-1、CD73和CD90的表达， 细胞免疫荧光三标技术检测CFs干细胞标记间的共表达情况。结果 酶联合消化法分离培养的CFs收获细胞量大， 第3代细胞活

2、力好、纯度高。Vimentin、FSP1和DDR2在CFs中均表达， 但DDR2在CFs中呈强表达。部分CFs分别表达nanog、c-kit、sca-1、CD73和CD90, 部分nanog阳性的CFs分别和CD73、CD90和sca-1, 及其CD90和sca-1存在共表达， nanog+/CD73+共表达阳性率最高 （59.02%±8.39%） , 与其他3组相比差异均有极显着性 （P0.05） , 但这两组与CD90+/sca-1+相比差异均有极显着性 （P 0. 05） . And the rate of nanog+/CD90+and nanog+/sca-1+ had

3、 extremely significant different with the rate of CD90+/sca-1+ （ P 0.05） , 但这两组与CD90+/sca-1+相比差异均有极显着性 （P0.01） ;CD90+/sca-1+共表达CFs阳性率均低于其他3组 （29.35%±3.7%vs59.02%±8.39%, 43.55%±3.92%, 43.78%±10.88%） , 差异具有极显着意义 （P0.01, 图5） .讨论CFs是心脏中数量最丰富的一种间质细胞， 分布广泛， 增殖迅速。其主要功能是合成和分泌细胞外基

4、质 （extracellular matrix, ECM） , CFs与ECM共同构成复杂而精妙的三维网络结构， 支持并连接心肌细胞， 调节心肌细胞机械、电生理活动， 在心脏正常发育和病理性损伤修复中发挥重要作用8,9.目前， 成纤维细胞尚缺乏特异性表面标记， 对成纤维细胞的鉴定也存在诸多争议。只有确保成纤维细胞鉴定准确后， 才能保证对其研究的精准性。Vimentin是最常见的成纤维细胞分子标记， 但该蛋白也可标记内皮细胞和神经元10;FSP1曾经被认为是成纤维细胞的特异性标记， 但淋巴细胞和肿瘤细胞也呈阳性表达11;DDR2也可标记成纤维细胞， 但白细胞和肿瘤细胞中也有表达。有研究显示， 在

5、心脏组织中， 心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞中未检测到DDR2表达12.本研究对体外分离培养新生大鼠CFs, 采用免疫组织化学分别检测vimentin、FSP1和DDR2表达。根据我们先前的研究认为， 除了根据以上这些标记物作为鉴定成纤维细胞之外， 还应该结合细胞来源、形态、分布等特征进行判断， 比如来自正常心肌组织的成纤维细胞不可能含有肿瘤细胞。另外， 根据细胞的形态特点可以明确地区别于心肌细胞 （有横纹） 和白细胞等13.综合分析， 本研究采用3种标记综合判断， 筛选出的成纤维细胞纯度是达标的、可信的。CD90为一种细胞表面黏附分子， 在细胞的黏附、凋亡、增殖和迁移等信号转导中发挥重要作用

6、。有研究证明， 体外分离培养肺成纤维细胞中存在CD90+和CD90-亚群， 它们在炎症反应和纤维化进程中发挥不同作用14.Rege等15证实， CD90+成纤维细胞更易转化为肌成纤维细胞 （myofibroblast, MFB） .心肌球来源 （cardiosphere-derived cells, CDCs） 的CD90-细胞在心肌梗死模型中则具有更大的修复潜能16.Ali等17证实， Thy1+、CD45-、CD31-、CD11b-、Ter119-是心肌成纤维细胞中的主要亚群。C-kit又称CD117, 酪氨酸激酶受体蛋白家族的重要成员之一， 是干细胞因子 （stem cell facto

7、r, SCF） 的受体， 它与SCF结合作为重要的受体配基复合物， 通过激活下游信号分子复合物， 产生强大的连锁反应， 从而在细胞分化、增殖中发挥重要作用18.与c-kit类似， 干细胞抗原1 （stem cells antigen-1, sca-1） 也是一种造血干细胞标记物， 在调控造血干细胞和c-kit表达中发挥重要作用19.移植分离培养心脏sca-1+/CD31-可实现对心肌梗死损伤的有效修复20.nanog是一种胚胎干细胞转录因子， 在维持干细胞多能性中发挥重要作用， 调控基因的转录并保持干细胞的未分化状态21,22.CD73在细胞生长发育、纤维蛋白合成及免疫应答等方面均发挥重要作用

8、23, Boiret等24证实， CD73在细胞增殖方面具有一定的促进作用。前期我们研究发现， 表达nanog蛋白的心脏成纤维细胞可能更具有干细胞样特性13, 且nanog在CD73+脂肪间充质干细胞 （adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, ADMSCs） 中呈现强阳性表达25, 且CD73+ADMSCs具有更强的向心肌分化能力26.为比较CFs在干细胞表达方面差异， 结合我们前期工作基础， 细胞免疫荧光对nanog、c-kit、sca-1、CD90和CD73表达情况进行分析， sca-1+所占比例最大， 其次为nanog+, 而c-ki

9、t、CD90和CD73阳性细胞所占比例下降。为检测CFs是否存在干细胞标记的共表达现象， 采取细胞荧光三标技术进行观察分析。结果显示， nanog+/CD73+共表达阳性率最高， 与其他3组相比差异均有极显着性；而nanog+/CD90+共表达CFs阳性率与nanog+/sca-1+之间差异没有显着性， CD90+/sca-1+共表达CFs阳性率均低于其他3组， 差异具有极显着意义。虽然这些干细胞标记物在成纤维细胞的表达存在差异， 但足以提示成纤维细胞具有显着的干细胞特性， 且干细胞标记存在重叠性表达现象， 至于它们在细胞增殖、心肌分化、心肌损伤修复等过程中的具体作用， 有待进一步探讨。参考文

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