外源DNA残留量测定(荧光定量PCR法)标准操作规程SOP

1、外源性DNA残留量测定法（荧光定量PCR法）标准操作规程文件编码： XXXXXX 目 录1.目的12.范围13.职责14.依据15.定义16.内容16.1.原理16.2.实验材料26.3.操作步骤36.4.结果计算66.5.判定标准76.6.注意事项77.相关文件78.附件79.变更历史71. 目的1.1. 规范外源性DNA残留量测定法（荧光定量PCR法）的操作过程。2. 范围2.1. 本规程适用于采用荧光定量PCR法对CHO细胞表达产品进行外源性DNA残留量的测定。3. 职责3.1. 方法学研究员负责严格执行本规程规定；3.2. 质量研究室负责人负责本规程的培训并监督本规程的执行。4. 依据

2、4.1. DNA残留量检测样品处理试剂盒（PrepSEQTM Residual DNA Sample Preparation kit，Applied Biosysterms）使用说明书。5. 定义5.1. LTR：long tandem repeat，长串联重复序列5.2. PCR：Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应5.3. Ct：阈值循环，即荧光信号强度超过设置的阈值强度时所经历的循环数6. 内容6.1. 原理CHO工程细胞所表达的蛋白质产品，其外源性DNA残留量的测定采用荧光定量PCR法。该方法是以荧光定量PCR仪为设备平台基础，选择CHO细胞中含量较丰富的

3、一段LTR（long tandem repeat，长串联重复序列）为靶标序列设计扩增引物，建立基于Taqman探针的定量检测实验。用已知量的CHO细胞基因组DNA做标准曲线，通过对Ct值进行线性回归计算样品中DNA的含量。6.2. 实验材料6.2.1. 试药与试液6.2.1.1. 灭菌水使用电阻率不低于18.2Mcm的超纯水，121灭菌20分钟以上。本方法所有试液均用灭菌水配制。6.2.1.2. 1mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH=8.0）称取60.57g 三羟甲基氨基甲烷（Tris），溶于400ml水中，用盐酸调节pH值到8.0，加水至500ml。室温保存。6.2.1.3. 0.5

4、 mol/L EDTA溶液（pH=8.0）称取93.06g乙二酸四乙酸二钠，溶于400ml水中，用氢氧化钠调节pH值到8.0，加水至500ml。室温保存。6.2.1.4. TE缓冲液量取1 mol/L Tris-HCl缓冲液5ml，0.5 mol/L EDTA溶液1ml，加水至500ml。室温保存。6.2.1.5. NaCl溶液称取58.5g NaCl用适量水溶解后，加入1mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH=8.0）4ml，并用水稀释至200ml。室温保存。6.2.1.6. DNA残留量检测样品处理试剂盒PrepSEQTM Residual DNA Sample Preparation

5、 kit购自Applied Biosystems，cat：，根据试剂盒说明将各组分分别贮存于室温或冰箱。6.2.1.7. 定量PCR预混溶液Premix Ex TagTM（Probe qPCR）购自TaKaRa cat：RR390A，每管启用前-20保存，启用后4保存，避免多次冻融。6.2.1.8. CHO-49引物探针探针引物序列如下：上游引物：TCgAggTTAAgAgCACCAACTg；下游引物：gATTgTTgTgAgCCACCATgTg；探针：CCAgAggTCCTgAgTTCAATTCCCAgC；引物混合物的配制：将上下游引物分别用TE缓冲液稀释至27mol/L，等体积混合后分装，

6、-20保存。探针的配制：用TE缓冲液稀释至10mol/L后分装，-20保存。6.2.2. 标准物质6.2.2.1. CHO 细胞 DNA 国家标准品购买自中国食品药品检定研究院，分装后-20保存。6.2.3. 仪器与用具荧光定量PCR仪、无菌1.5/2.0ml低吸附离心管（PCR级洁净）、离心机、洁净工作台、涡旋混合仪、水浴锅、移液器、防气溶胶带滤芯移液器吸头、磁力架（Applied Biosystems）、荧光定量PCR反应管/板。6.3. 操作步骤6.3.1. 标准曲线稀释取已分装的CHO 细胞 DNA 国家标准品，用TE缓冲液稀释到3105 pg /ml后，按下表分别进行10倍梯度稀释。

7、Tube编号稀释方法DNA浓度(pg /ml)SD1/3105SD250l SD1+450l TE3104SD350l SD2+450l TE3103SD450l SD3+450l TE300SD550l SD4+450l TE30SD650l SD5+450l TE36.3.2. 样品处理根据各品种项下具体要求，进行样品处理；如需采用试剂盒对样品进行残留DNA提取，应按以下步骤进行：6.3.2.1. 待测样品：根据各品种项下规定，取待测样品100l或200l于2.0ml的离心管，一般每批样品做三个平行。6.3.2.2. 加标样品：取待测样品100l或200l于2.0ml的离心管，并加入适量阳

8、性DNA，DNA加入量应约为样品DNA含量的210倍。6.3.2.3. 提取阴性对照（NEG）：取100l或200l的TE缓冲液于2.0ml的离心管，作为提取阴性对照。6.3.2.4. 以上各管加入10l（每100l样品）的NaCl溶液，调整盐离子的含量。6.3.2.5. 蛋白酶处理：各管加入蛋白酶K混合液70l（每100l样品），其中含蛋白酶K 10l、蛋白酶K缓冲液60l。56水浴30分钟。6.3.2.6. Lysis buffer Solution Mix的配制：Glycogen（5mg/ml）180l、tRNA（10mg/ml）4 l、Lysis Buffer 7600 l混匀，每管各

9、加入360l（每100l样品）。6.3.2.7. 37水浴处理磁性纳米颗粒（Magnetic Particles）10分钟，涡旋振荡使其充分混匀，直到磁性纳米颗粒完全悬浮，每管各加入30l（每100l样品），用吸头上下吸动几次混匀。6.3.2.8. 各管加入300l的Binding Solution（每100l样品），颠倒离心管两次，涡旋震荡5分钟。6.3.2.9. 快速离心15秒，将离心管放到磁力架上5分钟或直到溶液变清，吸掉上清。6.3.2.10. 各管加入300l的Wash Buffer（每100l样品），来回颠倒离心管两次，涡旋震荡5秒。6.3.2.11. 快速离心15秒，将离心管放到

10、磁力架上1分钟，吸掉上清。以相同的方法用Wash Buffer重复洗涤样品一次，最后将离心管管底的残留液体吸干。6.3.2.12. 打开离心管管盖，室温放置20分钟，让残留管壁的液体挥发晾干。6.3.2.13. 各管加入100 l的洗脱缓冲液（Elution Buffer），让磁性纳米颗粒充分悬浮。70水浴10分钟，在水浴过程中涡旋震荡离心管三次。6.3.2.14. 离心15秒，将离心管放到磁力架上2分钟，转移上清于干净1.5ml的离心管，高速离心3分钟，放磁力架1分钟。6.3.2.15. 转移上清于另一支干净的1.5 ml的离心管，作为供试品进行PCR反应。6.3.3. 定量PCR检测6.3

11、.3.1. DNA标准曲线配制：见6.3.1。6.3.3.2. 打开7500荧光定量PCR仪，预热至少30分钟。6.3.3.3. 加样PCR反应体系如下：加样成分每个反应体系加样体积Premix Ex Tag（2）15lRox Reference Dye（50）0.6l引物（各13.5mol/L）1.67l探针（10mol/L）0.9lTE缓冲液1.83l模板10l根据本次实验的反应体系数量计算各加样成分所需总体积，并将除模板以外的成分预先混合。于荧光定量PCR反应管/板中分别加入20l预先混合好的试剂，再分别移取DNA标准品、提取阴性对照（NEG）、阴性对照（NTC，为TE缓冲液）、待测样品

12、、加标样品各10l至稀释板中，设3个平行。6.3.3.4. 轻拍反应板并瞬时离心，去除底部气泡。6.3.3.5. 打开计算机和检测软件(SDS 2.0.6)。6.3.3.6. 在仪器选项卡下，设置如下参数：阶段1：95，30秒；阶段2：95，5秒，60，35秒，重复40个循环；反应体系体积：30l。6.3.3.7. 将反应板放置在7500荧光定量PCR仪中运行反应。6.3.3.8. PCR运行结束后，点击“Analysis”按钮，分析实验结果。6.4. 结果计算6.4.1. 计算实验结果：采用检测软件分析数据，得到标准曲线相关系数、各供试品Ct值、各供试品定量值等结果。6.4.2. 按照以下公

13、式计算回收率：回收率（%）加标样品定量值（pg/ml）待测样品定量值（pg/ml）100%加入阳性DNA终浓度（pg/ml）6.4.3. 实验有效性标准：标准曲线相关系数R2值应0.990；阴性对照Ct值应低于标曲3pg/ml点Ct值；加标样品的回收率应在50%150%之间。6.4.4. 外源性DNA残留量的计算如无特殊规定，按以下方式进行计算。6.4.4.1. 如待测样品定量值位于标曲范围内，按以下公式进行计算：外源性DNA残留量（pg/剂量）待测样品定量均值（pg/ml）剂量（mg/剂量）待测样品浓缩倍数蛋白质含量（mg/ml）6.4.4.2. 如待测样品定量值位于标曲范围外并低于3pg/ml的定量限，应采用3pg/ml进行限度分析，计算公式如下：外源性DNA残留量（pg/剂量）方法定量限（pg/ml）剂量（mg/剂量）待测样品浓缩倍数蛋白质含量（mg/ml）6.5. 判定标准见各品种项下要求。6.6. 注意事项6.6.1. 样品DNA提取过程中残余的乙醇和磁性纳米颗粒对荧光定量PCR反应有抑制作用，应小心操作，避免带入定量反应体系中。6.6.2. 为避免污染，样品DNA提取、PCR反应、