实验1-密度梯度离心法分离血液单个核细胞

1、实验1 密度梯度离心法分离血液单个核细胞姓名：李思露学号：一、 实验原理外周血细胞由密度不同的红细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、血小板等组成。对人血液来讲，其中红细胞密度最大，为1.091.11g/L；粒细胞密度次之，为1.0801.092g/L；单核细胞、淋巴细胞及NK细胞密度相近，为1.0501.077g/L；血小板密度最小，只有1.0301.060g/L；将其中的单核细胞、淋巴细胞、NK细胞等统称为外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC）。当将稀释的抗凝血叠加于适宜密度（与单个核细胞密度相近）的淋巴细胞分离液之上，经适当的离心力

2、离心一段时间后，不同种类细胞因密度而分布于离心管的不同位置，红细胞和粒细胞密度大于分层液，沉积于管底；血小板则因密度小而悬浮在血浆中；其中与分层液密度相当的单个核细胞分布在血浆层和分层液之间的界面。二、 实验材料、试剂及器材1. 材料肝素抗凝鸡血：先给注射器中吸入0.1mL 180IUmL肝素钠溶液，鸡翅下静脉采血5mL。 肝素抗凝绵羊血。2. 试剂（1） 肝素钠溶液：用生理盐水配成180IU/mL。（2） D-Hanks液。（3） 人淋巴细胞分离液：市售。20时密度应为（1.0770.001）g/L。3. 仪器和用具10mL低速离心机、托盘天平、一次性塑料注射器、10mL离心管、胶头滴管、4

3、0mL 小烧杯等。三、 实验操作（1）稀释血液：用D-Hanks液按1：1稀释抗凝血。（2）加样：先在10 mL离心管中加入2 mL鸡血淋巴细胞分离液，再沿管壁在距分层液界面上1 cm处缓慢加入2 mL稀释血。应注意保持两者界面清晰，勿使血液混入分层液内。（3）离心：2000 r/min离心20 min。（4）肉眼观察分离效果。（5）收集PBMC：用胶头吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出PBMC，转入另一离心管。 （6）制片观察PBMC：制备装片，显微观察所分离的细胞形态。四、 实验现象及结论1. 鸡全血细胞形态的观察将鸡全血稀释7-8倍，在40倍的显微镜下观察到的视野如下：视野中聚集了大量

4、 半透明椭球形的鸡全血细胞，有些细胞可以观察到有核的存在。图1 鸡全血细胞2. 肝素抗凝鸡血离心。离心前离心管上方是稀释血，下方是无色透明的人淋巴细胞分离液，二者有清晰的界限；离心后，管底为红色的细胞沉淀（红细胞和粒细胞），分离液和深黄色的血浆之间有灰白色薄层的PBMC。图2 密度梯度离心前后的细胞分布红细胞和粒细胞PBMC分离液血浆图3 离心后细胞在离心管中的分布3. PBMC形态的观察。视野中观察到PBMC的形态如下图所示：细胞不再如鸡全血细胞那么密集，且有聚集成团的现象，细胞形态不如鸡全血细胞规则。 图4 PBMC形态4. 绵羊全血细胞的观察。将绵羊全血稀释10倍，在40倍的显微镜下观察

5、到的视野如下： 红色的细胞即羊血的红细胞是内陷的，呈双面凹的圆饼状；而青灰色的细胞呈球形。哺乳动物红细胞无核的双面凹圆饼状结构，极大的提高了红细胞运输氧气的效率。绵羊全血细胞形态与鸡全血细胞形态有较大的差异。图5 绵羊全血细胞形态五、 注意问题（1）制备介质梯度及加样时注意不要破坏下层液面。（2）离心机加速、降速时应缓慢、平稳，以免突然震荡导致分层破坏。（3）分离不同密度的细胞时，应配制或选购对应密度的分离液。（4）与血液样品接触时应注意生物安全防护，避免血源性传染病。六、 显微观察技巧（1）旋转物镜转换器到10物镜，先将粗调焦螺旋外旋，使标本升至最高点。（2）一边用眼睛通过目镜观测标本，一边

6、逐渐向内旋转粗调焦螺旋，直至视野中出现晃动的液体，观测细胞即在其中。 （3）如视野中细胞太小，转换物镜至40高倍镜，一般稍微向外旋转微调焦螺旋即可看到清晰的物像。七、作业与思考题 1、向分层液上加完要分离样品后若拖延离心时间会出现红细胞沉至管底的现象。这会影响后面的分离结果吗？ 答：会影响。如果加样完成后不立刻离心，密度较大的红细胞和粒细胞等在沉至试管底部的过程中，从分离液间穿过，会使离心后各部分细胞的界限不清晰或者条带过宽，对分离PBMC造成影响。 2、细胞悬液加在分层液上面后离心的速度增大和减少分别可能出现什么情况？答：若离心速度的速度过快会损伤血细胞，甚至使血细胞裂解，对观察细胞形态造成影响；若离心速度过慢，会使细胞分离不完全，或者由于颗粒的扩散作用，会使区带越来越宽，对下一步分离PBMC产生影响。3、PBMC为什么