基因表达检测RTPCR

1、基因表达检测,Reverse Transcription PCR,RNA抽提,cDNA,反转录,基因特异性引导 Oligo(dT)引导 随机六核苷酸引物引导,PCR,Northern Blotting,基因表达分析,Northern Blotting,Awarded Nobel Prize for Chemistry in 1993,基因表达水平,梁大成等，2006,表达增强克隆的RT-PCR和Northern杂交分析,周斌，2001，硕士论文,mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR，RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，

2、它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法,实验原理,被污染的试剂，缓冲液 移液器 使用的器皿及tip等 操作者的手，头发等,RNA操作中应注意的问题： 防止RNase污染,外源RNase的主要来源,当处理RNA时，移液器专用 保证RNA实验用的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液等留出专用； 溶液和试剂分装成小份保存； RNA电泳装置专用（清洗、处理、DEPC处理过的水冲洗,防止外源RNase污染的主要措施(一,准备所有的溶液和缓冲液时，使用无RNA酶的玻璃器皿，DEPC处理过的水，用于RNA的化学药品使用专用药勺或直接敲击瓶底分离，可能的话，用0.1的DEPC在37C处理溶液1小时后在15psi(1

3、.05kg/cm2高压蒸气灭菌15min。 180300C烘烤玻璃器皿4hrs以上或用其它灭活RNA酶的商品化产品处理塑料制品； 使用新的、无RNA酶的一次性tubes, tips等； 在分离RNA的过程中用RNA酶抑制剂以抑制RNA酶的活性,防止外源RNase污染的主要措施(二,材料要新鲜; 裂解过程要同RNase活性抑制同步,防止内源RNA酶降解RNA,RNA酶抑制剂,RNA酶是一种很顽固的酶，在RNA分离和鉴定的各个阶段严重威胁RNA的完整性。用来使RNA酶不发挥作用的RNA酶抑制剂主要有,DEPC 氧钒核糖核苷复合物 RNA酶的蛋白质抑制剂,DEPC,是高度活性的烷基化试剂，通过组胺基

4、团乙氧基甲酸化形式破坏RNase的活性,氧钒核糖核苷复合物,能与多种RNA酶活性位点结合并几乎百分之百地抑制RNA酶的活性,RNA酶蛋白质抑制剂Ribonuclease Inhibitor,可与RNase形成非共价的复合物，从而使RNA酶失活。不能在变性剂如SDS、胍等存在的情况下使用,RNA EXTRACTION (mini prep,RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的调节和cDNA的合成都是必须的，RNA的纯度和完整性对于Northern blot, RT-PCR和cDNA文库的构建等分子生物学实验都至关重要。RNA分离的方法很多，最关键的因素是尽量减少RNA酶的污染,实验目的：

5、学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳带评价RNA质量 实验材料：水稻幼嫩叶片,苯酚/氯仿反复抽提 ，价廉但质不优，尤其是对多酚等含量高的材料不适 蛋白酶/SDS配合酚、氯仿抽提的方法 强变性剂法。硫氰酸胍，盐酸胍等，可 配合氯化铯离心或有机溶剂提取。 Trizol Reagent,提取方法,利用Trizol 试剂 抽提植物总RNA,Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。 用这种方法得到的总RNA中蛋白质和

6、DNA污染很少，可以用来做Northern,RT-PCR,分离mRNA，体外翻译和分子克隆等,75乙醇（in DEPC-treated water) 氯仿 异丙醇（RNA专用） RNase-free water：Draw water to RNase-free glass bottles. Add diethylpyrocarbonate （DEPC）to 0.1% . Let stand overnight and autoclave. 防止外源RNase的污染： 应戴口罩和手套，环境洁净；玻璃器皿180C烘烤3hrs以上；塑料制品DEPC水清洗，蛋白质变性剂处理；一次性用品如tube, t

7、ip等使用新的，无RNA酶的产品,RNA抽提前应准备的其它试剂及物品,操作步骤（一,液氮磨样，每管分装0.1克样品； 每管加1毫升Trizol 试剂（样品体积不超过Trizol 试剂体积的10），迅速混匀（若样品较多可先将混好的样品置于冰上）；室温下净置510分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离； 加200 l的氯仿，用手剧烈摇荡15秒，室温下静置5分钟左右,4. 2-8 ，12000g 离心10-15分钟； 将水相（上清）转入一新离心管，加0.5ml 异丙醇室温下沉淀10分钟； 2-8 ，12000g 离心15分钟； 弃上清，加1ml 75乙醇清洗RNA，振荡片刻后（务必使沉淀悬浮起来，以确保洗

8、涤干净），7500g 离心5分钟，小心弃上清； 室温静置515分，使RNA沉淀恰好干燥，加入20 l DEPC水溶解，保存于-70 。 取2 l 琼脂糖电泳检测RNA质量,操作步骤（二,RNA的琼脂糖凝胶电泳,用乙二醛/甲酰胺对RNA进行预变性，然后进行琼脂糖凝胶电泳 用甲醛和二甲基亚砜对RNA进行预处理，在含6或2.2mol/L甲醛的凝胶中电泳 检测 0.5TBE,In 1 MOPS 80 150V 40 min 1h30min,电泳,有溴化乙锭存在时，电泳后28S rRNA和18S rRNA在紫外灯下应当很清楚的看得到，还应当有一条由tRNA，5.8S rRNA和5S rRNA组成的较模糊

9、的迁移较快的带。如果RNA没有降解， 28S rRNA的亮度应当是18S rRNA的2倍，且这两条带都没有弥散现象,What does good or bad total RNA look like when separated in gel,Callus,Leaf,Degradation,Contaminant,Good,RNA产量低的原因,样品研磨不彻底，没有混匀，裂解不彻底 RNA没有完全溶解,RNA降解的主要原因,取样后没有立即抽提RNA； 抽提过程中超作不当，样品量超过了许可的范围； 样品运输、保藏不当，或RNA保藏不当，应放入-70 ，而不是-20 ） 使用的溶液或器皿有RNase

10、污染 琼脂糖变性胶（甲醛）电泳时pH值低于3.5,DNA污染的原因,样品太多，所加试剂相对太少 用来分离RNA的样品中含有机溶剂（乙醇，DMSO等），或碱溶液等,RT-PCR (Reverse transcription PCR,实验目的：学习RT-PCR的原理及其操作过程 实验材料：水稻幼嫩叶片RNA,目前PCR技术只能扩增DNA模板，对RNA模板不能直接扩增。mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增，这种在mRNA反转录后进行的PCR扩增称为RT-PCR。RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法,

11、实验原理,DNase I: 是将单链或双链DNA同等程度的随机分解，生成具有5P末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。Mg2+存在时，能在双链上产生切口；而Mn2+存在下能将双链DNA同时切断，使DNA片断化。 活性定义：以小牛胸腺DNA为底物，在25C、pH5.0的条件下，1分钟内使反应液的260nm吸光度增加0.001所需要的酶量定义为1个活性单位,用途： 与DNA Polymerase I一起用于切口平移 体外转录后除去模板DNA Mn 2+ 存在下为鸟枪法测序（shot gun sequencing) 制作 DNA文库 用于足迹法（foot printing)分析 DNA-蛋白质相互作用,

12、单链多肽，具有聚合酶和较弱的RNase H活性（或RNase H），最适反应条件：37 C, pH8.3,反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶,鼠白血病毒反转录酶 M-MLV,禽成髓细胞反转录酶 AMV,2条多肽链，具有聚合酶活性和较强的RNase H活性，最适反应条件41-45 C，pH8.3比pH7.6活性高,RNase H： 催化DNA-RNA杂合体的RNA部分的降解，产生不同链长带3羟基和5磷酸末端的寡核苷酸,Ribonuclease Inhibitor,单一多肽，可与RNaseA形成1：1非共价的复合物，从而使RNA酶失活。不能在变性剂如SDS、胍等存在的情况下使用。活性表达需要巯基

13、化试剂（DTT,本实验以水稻叶片RNA为材料，检测转基因水稻gus基因的表达。实验中设置一个看家基因作为阳性对照，判断RNA 的定量及反转录、PCR等过程是否有问题；设置一个不加模板RNA的阴性对照，主要是消除DNA及PCR试剂方面引起的假阳性；PCR 时设置一个以叶片DNA为模板的阳性对照，检验扩增带型是否来源于反转录的cDNA,实验设计,操作步骤（一） RNA Preparation,Prepare the plant total RNA by TRIzol Reagent. Dilute the Total RNA to the final concentration of 1 g /

14、l by DU640. . Combine the following in a 0.5 ml sterile eppendorf tube: Total RNA 3l (2-5g) RNase-free DNase l (u / l) 10 DNase buffer 1 l add DEPC-treated ddH2O 5 l Incubate at 37 for 15 min, then 70 for 10 min,操作步骤（二）Reverse Transcriptase Reaction,Add 1 l 500 g / ml oligo (dT) 15 primer, mix the c

15、ontents of the tube by gently vortexing and collect the reaction by brief centrifugation. Heat the mixture at 70 dry bath for 10 minutes, then put on ice for 5 minutes. Add the following contents: 5 first strand buffer4 l RRI1 l 10 mM dNTP 1 l M-MLV (200 U / l) 1 l DEPC H2O 2 l,操作步骤（二,4. incubate at

16、 37 for 1 h. (The total volume should now be 20 l) 5. Inactive the reaction by heating at 70 for 15 min, then add 20 l ddH2O and the first strand of cDNA can be used as a template to amplification in PCR. 6. To remove the RNA complementary to the cDNA, add 1 l (2 units) of RNase H and incubate at 37

17、 for 20 min,PCR技术,PCR（多聚酶链式反应是一种体外扩增特异DNA片段的技术，是分子克隆技术中最常用的技术之一，是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性（denaturation，）退火（annealing）、延伸（extension）三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增,The Invention of PCR,Invented by Kary Mullis in 1983. First published account appeared in 1985.

18、 Awarded Nobel Prize for Chemistry in 1993,模板DNA：一般102105个拷贝 Mg2：Mg2能影响反应的特异性和扩增片段的产率。一般反应体系中1.5-2.5 mmol/L 反应反冲液 ：使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。 dNTP：在PCR反应体系中其浓度一般为 20200 mol/L，浓度过高、过低都不利。 Taq DNA聚合酶：在7075C具最高活性。具有53的聚合酶活性和53的外切酶活性，无校正功能。是镁依赖性酶。 引物：PCR反应中引物浓度一般为0.10.5 mol/L,PCR反应体系中的主要成分及其作用,变性：模板DNA由双链变成

19、单链，使有利于与引物结合。可根据模板的复杂程度调整变性温度和时间，一般情况下94C 30秒可使各种复杂的DNA分子完全变性（过高的温度或高温持续时间过长，可对Taq DNA聚合酶活性和dNTP分子造成损害）。 退火：变性的DNA快速冷却至4060C可使引物和模板DNA发生结合。可根据引物的长度和GC的含量选择复性温度。退火时间30秒。 延伸：一般是7075C，此时Taq DNA聚合酶活性最高。1kb的可适当延长时间。 循环次数：理论上2025个循环PCR产物的累计即可达到最大值、实际操作中2530较合理。循环次数越多，非特异性产物的量也会增加,循环条件的设定,Thermal Cyclers,P

20、CR machine available from many suppliers. Many block formats and multi-block systems. Reactions in tubes or 96-well micro-titre plates,在冰上配制下列反应体系 : First strand cDNA 2 l TaKaRa Ex Taq (5 u / 1 l)0.5 l 10 Ex Taq buffer2 l dNTP mixture (2 mM)2 l Primer F (10 mM)0.5 l Primer R (10 mM)0.5 l ddH2O12.5 l

21、 混匀后，短暂离心，每管加一滴矿物油,操作步骤（三） PCR,PCR反应循环条件设置： 根据引物及基因的表达水平设置循环参数：如引物序列、引物长度、扩增片段的长度及mRNA 的丰度等,检测：加2 l溴酚蓝，混匀，取15 l反应产物电泳； 在1%的琼脂糖凝胶上点样电泳；EB染色，紫外观察,引物序列,反应程序： 94度 45秒， 58度 45秒， 72度 60秒， 27 CYCLES. Genome: 750 bp cDNA: 250 bp,2KB cDNA ZH11 H2O,actin,本次RT-PCR实验使用的引物： 报告基因：GUS 组成型基因：GAPDH,Taq酶过多； Mg2+浓度不合适； 引物浓度过高或设计不合理； 复性温度过低； 循环次数过多； 模板量过多,PCR产物的电泳检测时出现拖带或非特异性扩增带的可能原因,PCR扩增产物电泳检测,Optimisin