上课用)-特殊染色和组织化学ppt课件

1、特殊染色及组织化学,赣南医学院病理学教研室,第一节 特殊染色及组织化学的基本知识,一、染色方法 1863年由waldeyer率先倡导用苏木素染液染细胞核，后来Mallory、Mayer等也阐述过苏木素的应用。近年来特殊染色和组织化学方法也屡有创新。Shikata(1973)，Tanka等(1981年)分别介绍了用地依红和维多利亚蓝混合液显示乙型肝炎表面抗原的方法；1987年Crocker J等推出了核仁组成区嗜银蛋白染色的技术方法以及1991年进行的乳腺肿瘤核仁组成区的研究方法等,二、染色目的,未加染色的任何组织切片在镜下只能辨认细胞和胞核的轮廓，看不清楚其他任何结构。染色的目的就是将组织切片

2、浸入染色剂内，经过一定的时间，将组织或细胞及其他异常成分染上不同深浅的颜色，便于在光学显微镜下进行观察,三、染色原理,染色过程是染色剂和组织细胞相结合的过程。其机理尚未完全清楚。 1、有学者认为从物理学角度看，染色剂和组织细胞的结合是“溶解”或“吸收”。例如苏丹类染色剂使脂质着色，就是利用染色剂在脂质中的溶解度大于在酒精等溶剂中的溶解度这一特性。有些染色剂是染色剂分子通过渗透和毛细血管作用而被吸收或沉淀到组织、细胞的小孔中去而着色的这种机制的染色是很少的,2、另有学者认为染色是染色剂与组织、细胞之间的化学性结合。如显示含铁血黄素的普鲁士反应是最典型的例子。 但是，大量染色的化学反应并不象铁反应

3、那样明确。大多数染色的原理至今仍未搞清楚，有些可能是物理性的，有些可能是化学性的，有些则可能2种机制都起作用。正因为人们对染色的原理还没有完全掌握，所以还不能很好地运用原理来控制它，在相当程度上需凭工作经验,四、染色的分类,一)普通染色 最广泛应用于常规制片的苏木素和伊红染色，又称为常规染色,二)特殊染色,1定义 专门用于显示某些特定目的物的染色方法称为“特殊染色”，它又可以理解为“选择性染色”。 特殊染色对目的物的选择性是相对的。有些方法具有相对的特异性，如油红O等脂质染色，显阳性者可以肯定为脂质；有些则显示的是一类物质，如PAS呈阳性反应者有糖原、粘蛋白、网织纤维、软骨、阿米巴原虫、霉菌等

4、许多物质和组织结构，并不能确定是哪一种具体成分,所谓特殊染色的相对性，就是一种方法可以显示多种目的物，一种目的物可以用多种方法显示，其中有些方法可能呈阳性，而有些方法则呈阴性，这就需要我们拿捏多种方法，因为有时只有依靠多种方法才能确定所要确认的目标,2.特殊染色的分类,特殊染色方法按照所染目的物进行分类，有结缔组织、肌肉组织、神经组织、脂类物质、糖类、色素、病理的内源性沉着物、病原微生物、内分泌物质、骨、血液及造血组织、核酸、酶类等,3.特殊染色的命名,对于特染的命名至今尚无统一的规定，多数均按发明者的姓名命名，如van Geison染色等；有的则按所用染色剂命名，如甲基绿一派若宁染色、苏丹染

5、色等；有的按目的物命名，如网织纤维染色；还有的采用混合命名，如试剂十人名等,4特殊染色的意义,1)显示在常规HE染色切片中不明显的目的物,如病变中霉菌数量较少时，应用Gridley染色就容易发现 2)可以区别胶原纤维和平滑肌，苏丹染色可区别脑浆内的脂肪变和水样变。 3)可以显示某些HE染色中不能看到的目的物。如网织纤维、星形细胞的突起、结核杆菌、螺旋杆菌等，都可用相应的特殊染色法显示。 因此，特殊染色是常规染色的必要补允，也是染色技术中不可缺少的组成部分。它在病理诊断中起着辅助作用,五、组织化学的基本概念,组织化学是在形态学基础上研究细胞或组织中物质的化学组成、定位、定量及代谢状态的学科，是组

6、织学与生物学及生物化学等的边缘科学，其目的是联系形态，化学成分和功能来了解组织或细胞的代谢变化。 目前有许多组织化学方法已划入特殊染色，划分特殊染色和组织化学无绝对界限,六、方法和种类,1、化学方法 根据其化学反应的原理，在组织切片上生成沉淀，显示定位。 2、类化学方法 有少数方法的染色反应有特殊性，但机制不明。 3、物理方法 应用物质的物理学特性，如苏丹、油红染料易溶于脂类而使脂类染色,七、操作掌握的要点,1组织材料及时切片与染色，才能保持组织细胞良好的形态结构。 2染色切片的判断，应把病变的形态、部位及相应的理论一起进行综合分析，可借助阴性及阳性对照，正确分析实验结果。 3生成的反应产物必

7、须在原位沉淀，着色深，且不溶，为细小沉淀或小结晶。能保证定位的精确性及稳定性，便于反复观察,1.虽然形成了许多显示细胞化学的方法及一些特殊染色。但发展的速度比较缓馒。这是因为每一种方法都有自己不相同的试剂、底物和方法，在发展上既没有系统的经验可以遵循，在学习使用上也比较困难。 2.自从免疫组织化学问世以来几乎所有的组织化学成分都可以用免疫组织化学方法检测，所以组织细胞化学的许多方法大多数被免疫组织化学所代替。 3.有些组织化学方法定性准确，方法简单、使用方便或因试剂便宜，至今沿用不衰,第二节 糖原和粘液物质染色,一、糖原 糖原在肝细胞、心肌细胞、骨胳肌细胞内含量最多，其次是毛囊、子宫腺体、阴道

8、上皮、脐带等处均有少量糖原存在。 糖原易溶于水，在酶的作用下容易分解为葡萄糖。葡萄糖更易溶于水，故机体死亡后糖原易受到破坏，其含量发生明显变化甚至完全消失。用常规HE染色观察不到糖原的形态，用显示糖原的特殊染色也难以观察到糖原的形态及分布。所以为了观察和研究组织内糖原的含量及分布、必须选取新鲜标本，用能保存糖原的固定液及时固定，再经特殊染色后才能将糖原显示出来,一)固定方法及注意事项,1)尽可能选取小块新鲜组织并及时固定。 2)多次更换乙醇混合固定液，在4左右内固定与保存。这是针对糖原的性质和避免糖原溶于水而采取的相应措施。乙醇虽然是保持糖原的较好固定剂，但是用单一的乙醇尤其是用无水乙醇固定肝

9、、肌肉等实质性组织时，固定作用迅速而穿透力弱，组织表面会很决凝固变硬。这样由于固定不透和不均，糖原同样不能得到较好的保存，易出现糖原颗粒趋于细胞一端的极化现象。 目前固定与保存糖原的固定液，以乙醇为溶剂配制含甲醛、冰醋酸及苦味酸等混合固定液为好：此类固定液利用乙醇防止糖原溶解于水；利用冰醋酸和苦味酸的膨胀及软化作用，抵消乙醇对组织的收缩硬脆；利用甲醛对组织固定的渗透力强、固定均匀等优点。其固定原理是使与糖原相结合的蛋白质凝固,二)常用固定液,1Gendre固定液 苦味酸无水乙醇饱和溶液(约8. 96)80ml，甲醛(38一40)5ml，冰醋酸5ml。临用前配制。取小块组织置于4冰箱内固定14小

10、时，固定期间更换23次新液。固定前组织禁用水洗，直接用80乙醇浸洗数次后，至95乙醇开始脱水。 2Lillie固定液(AFF) 无水乙醇85ml，冰醋酸5ml，甲醛(38%一40%)10ml。此液为优良的固定液。配制及使用方法与Gendre固定液相同。固定后组织可直接用95乙醇开始脱水。 3Rossman固定液 苦味酸无水乙醇饱和液90ml，甲醛(38一40)10ml。临用前配制，取小块新鲜组织于4冰箱内固定12d，更换23次新液，然后在室温下用95乙醇浸洗数次，经无水乙醇脱水,三)糖原染色应用,1细胞内泡状变性的鉴别 在常规石蜡切片的HE染色中，如胞浆内出现大小不等的空泡，应考虑可能是脂肪变

11、性，经脂溶剂的脱水透明过程溶解而形成的空泡；也可能是糖原在经水溶液固定过程中的脱失所致；或可能是单纯的水样变性。为了鉴别其性质，则需要用显示糖原或脂质染色法加以证明,2在心肌病变及其他心血管疾病的研究 用显示糖原的特殊染色，可以观察到由缺血缺氧所致急性早期心肌坏死病灶内的糖原明显减少甚至消失，呈均质的浓染状态，而病灶周围则出现反应性异常糖原增多；已愈合的心肌梗死灶周围的心肌纤维内可有糖原颗粒浸润；心肌的横纹肌瘤也有大量糖原存在,3糖原累积病的诊断及研究 用显示糖原的特染方法可观察到由先天性遗传缺陷引起的糖原累积病时，心、肝、肾、骨骼肌、单核吞噬系统等器官内均有大量的糖原堆积。 4糖尿病诊断及研

12、究 在患糖尿病时，肝细胞、肾曲小管上皮细胞、心肌纤维内均可见糖原颗粒沉着，其含量的多与少和血糖水平呈平行关系,5用于某些肿瘤的诊断与鉴别 鉴别肝细胞癌与胆管癌、前者糖原染色为阳性，后者为阴性； 鉴别横纹肌瘤与颗粒细胞母细胞瘤，前者为阳性，后者为阴性； 骨尤文氏瘤、汗腺瘤、横纹肌肉瘤、化学感受器瘤、脊素瘤等，用糖原染色均可显示为阳性,四)显示糖原的方法,1.Best胭脂红染色 2.过碘酸雪夫反应法(PAS) 3.Bauer铬酸雪夫反应,过碘酸雪夫反应(PAS,此法能显示糖原，而且还能显示中性粘液性物质和某些酸性粘液性物质以及软骨、脑垂体、霉菌、脂质、色素、淀粉样物质及基底膜等。故PAS法在病理学

13、上可用于多种疾病的研究。 其染色原理为：过碘酸是一种氧化剂，它能氧化糖类及有关物质中的l，2一乙二醇基，使之变为二醛；醛与Schiff(雪夫试剂)结合生成种品红化合物，即形成红色取代色素而得到定位,染色步骤,I)石蜡切片35m，脱蜡至水洗。 2)蒸馏水洗12min。 3)用1%过碘酸水溶液氧化510min。 4)充分水洗。 5)蒸馏水洗涤数次。 6)用Schiff试剂浸染5一10min，如温度低时可延长浸染时间,7)倾去Schiff试剂，直接流水冲洗10min。 8)用明砚苏木素染液浅染胞核23min，过染时可用o5盐酸乙醇液稍分化。 9)流水冲洗5一l0min。 10)乙醇脱水，二甲苯运明，

14、中性树胶封固,注意事项,1)过碘酸的浓度在o5一2范围内，其染色结果无显著差异，但一般多采用在0. 5%一1%的浓度、其PH为35之间。 2)用过碘酿液氧化时的温度及作用时间值得注意。若温度高、作用时间长可使某些物质成分发生非特异性反应，结果会出现假阳性，以其氧化时间应控制在5一10min、环境温度不高于20为宜，室温稍高时其氧化时间应适当缩短,3)配制雪夫试剂的方法很多，其基本原理都是将碱性品红与亚硫酸氢钠等作用，变成无色终产物，故较为理想的雪夫试剂应为无色透明溶液。当贮存的溶液变为橘红色或粉红色时，即说明已变质失效而不能再用。 4)亚硫酸氢钠冲洗液必须在临用前配制，用过的或放置后溶液不能再

15、用。经此液作用后，PAS阳性物质显红，以淡染为宜。 5)复染核不要过深，应淡染为宜,二、粘液物质,人体各种腺体及其他组织、细胞所分泌的粘液类物质大体上相似，统称为粘液。按其化学结构和物理状态的不同，粘液物质由粘多糖和粘蛋白组成,粘多糖,粘多糖包括： 1、酸性粘多糖 2、中性粘多糖 两者均以氨基已糖为主要成分,粘多糖,1)酸性粘多糖：其基质成分以硫酸性和唾液酸性2种形式存在，广泛地分布于全身各处。正常生理情况下，主要存在于消化道、呼吸道及其他部位的粘液腺分泌物中，在滑膜、玻璃体、角膜、脐带等处尤为丰富，硫酸软骨素和肝素为复杂的酸性粘多糖。硫酸软骨素分A、B、C3型，存在于软骨、结缔组织、肌腱、血

16、管和皮肤的基质内；而肝素则存在于肥大细胞的胞浆中,2)中性粘多糖： 主要存在于胃粘膜表面上皮、幽门腺、十二指肠的勃鲁钠腺等处，不如酸性粘多糖分布广泛,粘蛋白,粘蛋白是由糖和蛋白质相结合而构成，故又称糖蛋白。见于各种组织上皮和腺体导管的分泌物中，在垂体前叶的嗜碱性细胞所含促生殖腺激素和促甲状腺激素中也可见到粘蛋白，还有一些存在于血清中,粘蛋白,在同一种上皮和腺体内常可同时分泌2种粘液物质，而在同部位的分泌物中两者的比例和含量都有所不同,粘蛋白,粘液物质一般具有下列性质： 对异染性染料具有异染性； 对碱性染料具有很强的亲和力； 除胃粘蛋白外，其他粘液遇醋酸时都会发生沉淀； 可溶于弱碱性溶液,粘液染

17、色的应用,用于一般粘液性病变的观察 在病理状下，结缔组织、肾等一些实质性脏器，可出现粘液水肿、粘液变性和粘蛋白的增多。常规HE染色，粘液呈污秽和淡蓝色，很不清楚，如用粘液物质染色可以得到满意的结果,粘液染色的应用,肿瘤的诊断和鉴别诊断 胃癌在粘膜表面上皮和癌组织内均可见到呈阳性反应的粘液物质。同时还可证明癌细胞是否浸润到间质中；粘液染色对观察肠上皮化生也是很有意义的,对肺部某些肿瘤的观察。 粘液瘤和粘液肉瘤用粘液物质染色均呈阳性，可以明确肿瘤性质，确立诊断。 软骨粘液样纤维瘤、胚胎样横纹肌肉瘤，用粘液染色均呈阳性,鉴别粘液表皮样癌与鳞状上皮癌时，前者呈阳性，后者呈阴性。 鉴别粘液腺癌与低分化鳞

18、癌，前者呈阳性，后者呈阴性。 鉴别滑膜肉瘤与软组织腺泡状肉瘤、间皮瘤、腺泡状横纹肌肉瘤，滑膜肉瘤呈阳性，后者呈阴性,用于动脉粥样硬化、胶原病、粘液性水肿、Marfan氏综合征等其他疾病的诊断和研究,组织固定方法,采用含汞盐的固定液固定效果最佳。如果是已用甲醛或乙醇固定的组织，应在切片脱蜡后用5氯化汞水溶液媒染5min，再用碘液和5硫代硫酸钠水溶液作脱汞处理，可得到一定的改善。应注意粘液物质不能用碱性甲醛等固定液固定，以免大量的酸性粘多糖被溶解,染色方法,1、异染反应法 2、Mayer胭脂红染色法 3、Southgate胭脂红染色法 4、Hale改良胶质铁染色法 5、PAS过碘酸雪夫反应法 6、

19、AB-PAS爱先蓝过碘酸雪夫反应法 7、Culling爱先蓝醛复红染色法 8、爱先蓝染色法,AB-PAS爱先蓝过碘酸雪夫反应法,第 三 节 病理性色素及沉着物 的组化染色,一、黑色素,镜下黑色素常为淡黄棕色至深褐色的颗粒，大小不等，形状不一，均匀地散布于胞质内或胞质的边缘，皮肤中的黑色素是由一种被称为黑色素母细胞所产生，它来源于神经嵴，在胚胎发育过程中，由神经嵴移行到皮肤等处。这种细胞含有合成黑色素所必需的酪氨酸氧化成黑色素,人体中的黑色素，主要存在于皮肤的基底细胞、毛发的毛球、眼球的虹膜和睫状体、中脑的黑质，偶见于淋巴结。在病理情况下，良性肿瘤的可见于痣，恶性肿瘤的可见于恶性黑色素瘤,显示黑

20、色素的方法有Masson-Fontana。该法的染色原理主要是根黑色素具有还原硝酸银的能力，把黑色素还原为于镜下可见的黑色金属银。另外，应用免疫组织化学的方法，也可将黑色素给予显示出来，如S100，HMb45,黑色素染色的应用,用于黑色素瘤的诊断 在疑为黑色素瘤时，常需黑色素染色。当肿瘤黑色素很少时，黑色素染色可使黑色素容易发现，当病变内黑色素含量多时，可用漂白法以便观察核的结构和核分裂现象,其他 色素性神经瘤、透明细胞肉瘤也有黑色素存在；皮病性淋巴结炎时，淋巴结内也可有黑色素沉着,黑色素染色的应用,黑色素染色的应用,皮肤病 黑色棘皮病、老年疣、白癜风、色素性荨麻疹、瑞尔黑变病、网状色素性皮肤

21、异色病、红斑狼疮、扁平苔藓和许多内分泌代谢性疾病(阿狄森病、肝病等)，这些疾病的皮肤中都有色素沉着或脱失。在必要的情况下用黑色素染色法,黑色素染色的应用,神经黑色素 中枢神经系统的黑质、蓝斑以及其他部位神经细胞的色素与皮肤的黑色素稍有区别，又称神经黑色素。通过黑色素染色法，可供神经研究的参考,黑色素染色的应用,假性黑变病色素 这种假性黑色素主要见于大肠，又称为结肠黑变病。在临床上见于严重便秘和习惯用鼠李皮作缓泻剂者。在固有膜巨噬细胞内有一种性质不明的色素，普鲁士蓝反应弱阳性，PAS阳性。有人认为是含铁血黄素与肠道内细菌黑色素脂褐素相似的物质,染色方法,切片脱蜡至水。 入氨银液于暗处作用12-2

22、4小时。 蒸馏水速洗数秒。 0.1%氯化金水溶液调色5min。 蒸馏水洗2min,5%硫代硫酸钠定色10min。 流水冲洗5-10min。 Van Gieson或核固红作对比染色。 酒精分化至水洗。 脱水，透明，封固,Masson-Fontana银浸法,结果：黑色素，亲银颗粒，嗜铬颗粒呈黑色，背景呈对比染色,注意事项： 对比染色如用an Gieon则95%分化，如用核固红，则需水洗10分钟以上。 由于该法可用于亲银反应，因此如要区别黑色素及亲银颗粒时应注意它们之间的区别。 浸染切片不可用微波炉处理，因此该法要在暗处进行浸染，而微波炉内工作时有灯光照明，会影响结果，如需要快速浸染需用微波炉处理时

23、，染液瓶外必须用黑纸紧围起来方能进行，处理时间可在5-10min左右,二、淀粉样物质,定 义,淀粉样物质是一种无细胞的同质性的嗜伊红性物质，因为在用碘染色时与淀粉的反应相似，故称为淀粉样物,淀粉样物的化学成分,90%淀粉样原纤维蛋白。 淀粉样轻链蛋白（由浆细胞分泌的免疫球蛋白）。 淀粉样相随蛋白（来源于血浆中的免疫球蛋白）。 10%为糖蛋白,淀粉样物的性质,超微结构的研究证明它是由具有固定物理性质的蛋白原纤维构成。每个纤维约为7.5豪微米宽。Glenner等人研究证明，淀粉样物是由排列呈折叠结构的轻链多肽所构成,HE染色后的形态,用HE染色后，它被染为均匀一致的淡粉红色，与胶原纤维玻璃样变是基

24、本一样，不易鉴别,五）病变最常累及的器官及大体特征,肝、脾、肾和肾上腺。 器官变大，坚实，切面呈灰白色半透明状，严重时组织呈蜡样结构,六）淀粉样物的种类,1、原发性淀粉样物：见于肌肉，心脏，皮肤和舌头。 2、继发性淀粉样物：见于肝、脾、肾脏和肾上腺。 3、多发性骨髓瘤并发的淀粉样物与免疫系统有关。 4、肿瘤和肿瘤有关的淀粉样物：如骨髓瘤、甲状腺髓样瘤,七）淀粉样物质染色应用,显示淀粉样变性程度 在心、肾、脾、淋巴结、甲状腺、舌、喉、肠道、血管及皮肤等处较易出现全身性淀粉样变性时，均可用淀粉样物质染色法显示以区分变性程度,七）淀粉样物质染色应用,用以区分淀粉样变性与其他变性 在胶原纤维和网状纤维

25、周围、小动脉、血管外膜及毛细血管血窦等出现变性时，可用淀粉样物质染色法进行显示和区分其性质,用于肿瘤的诊断与鉴别 某些肿瘤，特别是内分泌肿瘤，间质内时常会出现淀粉样物质沉着，如甲状腺髓样癌、胰岛细胞癌、肺小细胞癌等,七）淀粉样物质染色应用,七）淀粉样物质染色应用,4皮肤组织的淀粉样变性 多沉积于真皮的乳头层内。可见于皮肤脂溢性角化、老年性角化、皮脂腺痣、红斑狼疮,七）淀粉样物质染色应用,为某些疾病的诊断与鉴别提供依据 钙化上皮瘤，声带息肉，老年人胰岛、脑垂体及前列腺腔内，时常会出现淀粉样变性,八）染色方法,1Jurgens甲基紫法 2PuchtlerSweat一Levine法 3Freuden

26、rhal改良刚果红法 4Cole(高PH值)刚果红法 5. Dennhold刚果红法 6Highman甲醇刚果红法,切片脱蜡至水， 0.5%甲基紫染色2min， 自来水洗3min， 0.1%醋酸水溶液分化，直至呈现粉红色或红色，胞核呈蓝色， 自来水洗，摔去多余的水分， 用Apathy氏或阿拉伯胶封固。 结果：淀粉样物为粉红色至玫瑰红色。其余组织呈蓝色至紫色,Jurgens甲基紫法,注意事项： 这是一种变色反应的方法，所谓变色反应即使用一种颜色的染液，最后形成的结果却为另外一种颜色，故称为变色反应。 该法的切片不能用酒精脱水，因酒精可将着染的颜色全部褪掉，也不宜用甘油明胶封固。 所用的甲基紫，也

27、可用结晶紫代替效果基本一样。 由于切片是带水封固，因此不能做长期保存，如要摄影，应从速进行为好,改良的刚果红甲醇法,切片脱蜡至水， 用刚果红甲醇液染1020min， 用碱性酒精分化几秒钟，需于镜下控制，勿使之过度分化， 流水冲洗3-5min， 浅染细胞核， 水洗2min， 常规脱水，透明，封固。 结果：淀粉样物呈粉红色至玫瑰红色，核呈蓝色,Freudenrhal改良刚果红法,此法经改良后有较好的效果，故较为常用。 染色步骤 1)切片脱蜡至水。 2)浸入10甲醛液，1530min。 3)直接入刚果红染色液15min。 4)经自来水铣2min，蒸馏水稍洗。 5)入Mayer或Ehrlish苏木素液

28、2min。 6)自来水洗后入0. 5盐酸乙醇分化。 7)充分水洗返蓝。 8)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。 结果淀粉样物质呈鲜红色，胞核呈蓝色,第 四 节 结缔组织和肌肉组织染色,胶原纤维,胶原纤维是人体中的结缔组织的主要成分，分布在全身的各个部位，组成胶原纤维的主要成分是胶原蛋白。新鲜时呈白色，故一般称为白色纤维。在HE染色中被染为淡红色,胶原纤维具有一定韧性及紧固性，因此它能够抵抗一定的牵拉力而不至于撕裂或拉断。它们常聚集成粗细不等的束，呈波浪状。胶原纤维由许多根纤细的胶原纤维组成。在电镜下胶原原纤维又由更细的原纤维构成,根据Kramen和Little所进行的电镜研究证实，胶原纤

29、维是特有的、具有横纹的原纤维。当有病变时这些纤维可发生变形，常出现的就是胶原纤维的坏死，胶原纤维在稀酸里可发生膨胀，变成胶样物。它们能被酸性染料染成深浅不一的粉红色，这些往往跟淀粉样物难以区别。由于它们的屈光率较弱，因而在光学显微镜下，很难与纤维区别。胶原纤维的分子长度约为3000，直径约为14，分子量为300000,胶原纤维染色在病理诊断上 1、主要用于鉴定梭形细胞肿瘤的组织来源，即在纤维、平滑肌和神经三者之中作出选择。 2、在其他情况下，如观察动脉硬化的心脏时，在HE切片中心肌内散在的小瘢痕灶被染成红色，而作胶原纤维染色可将胶原组织和心肌组织明显区分开来。 3、早期肝硬化用胶原纤维染色，也

30、可使小叶间少量增生的胶原纤维突出地显示出来,染色方法,Van Gieson（V.G）染色法 Masson氏三色染色法 Siriured染色法 Lillie改良Van Gieson法 Biebric猩红染色法 苦味酸氨基黑染色法,Van Gieson（V.G）染色法,注意事项： Weigert氏苏木素临用前取A液和B液等份混合，几个小时内用完，最长不得超过一天。 苏木素配后经二十多天才能成熟，必须提前配制。 该液能抵抗弱酸性染液，对已着染的细胞核在酸性染液的作用，不易被脱去颜色，如果不特别深染，则无须分化。 Van Gieson氏液取B液9ml，加入A液1ml，即可使用,Van Gieson（V

31、.G）染色法,染色步骤： 切片脱蜡至水， 用Weigert氏苏木素染20min， 水洗，必要时可分化， 流水冲洗10min， 染Van Gieson氏液1min， 用95%酒精快速分化， 无水酒精脱水，二甲苯透明，封固,Van Gieson（V.G）染色法,结果： 胶原纤维：鲜红色， 肌纤维： 黄色， 红细胞： 黄色， 细胞核： 蓝黑或灰色,Van Gieson（V.G）染色法,注意事项： 1、该法染完的切片，较易褪色，如需照相，应尽早完成。 2、苏木素染液如为棕色或沉淀，应将其抛弃。 3、分化用的酒精，应使用95%以上的酒精，低浓度的酒精褪色能力强，容易将着染的红色脱去。 切片也可以用天青兰

32、苏木素替代Weigert氏苏木素，染核效果基本一样,网状纤维,网状纤维是一种纤细的纤维。它沿着网状细胞和突起分支，并互相交织成网，因而被称为网状纤维，又因这种纤维对银的浸染着色特别显著。故又称为嗜银纤维。它主要由III型胶原蛋白构成，也具有642nm周期性横纹1。它主要分布于骨髓、脾、淋巴结、肝和肺等脏器。癌组织中间未见有网状纤维，但在其边缘可见有大量的网状纤维，俗称癌巢,网状纤维的形成,它的形成主要是在纤维母细胞的粗面内质网中，合成可溶性胶原。在醛糖、类脂的作用下，形成可溶性胶原，随后它被分泌到细胞外，在基质中（或在细胞的表面）通过原胶原蛋白分子间的交联，聚合成为不溶性的胶原原纤维即网状纤维

33、,网状纤维在组织化学上的反应,网状纤维的主要成分是网硬蛋白，在组织化学上，网状纤维和胶原纤维是容易区别的。网状纤维是分支纤细的纤维。Van Gieson 氏染色不显色或微红色，PAS反应呈现红紫色，银浸染为黑色。胶原纤维用Van Gieson氏染色为红色，PAS反应呈微粉红色，银浸染为黄色或棕黄色,网状纤维染色的应用,用于显示和鉴别肿瘤的性质和来源 显示和区分癌与肉瘤： 来源于上皮组织的恶性肿瘤（癌）周围有网状纤维包绕，巢内癌细胞之间则没有网状纤维分布；来源于间叶组织的恶性肿瘤（肉瘤），瘤细胞之间往往可见较多的网状纤维存在,用于显示和鉴别肿瘤的性质和来源 (2)区分血管内皮瘤与血管外皮瘤： 恶

34、性血管内皮瘤的瘤细胞主要在嗜银纤维鞘结构以内，单个细胞则无嗜银纤维围绕；恶性血管外皮瘤的瘤细胞均位于小血管之间网状纤维鞘之外，并有丰富的网状纤维自小血管壁向外呈放射状包绕瘤细胞,网状纤维染色的应用,网状纤维染色的应用,用于显示和鉴别肿瘤的性质和来源 (3)用以鉴别恶性淋巴瘤与网状细胞肉瘤 在恶性淋巴细胞瘤中产生的网状纤维比在正常淋巴结内的网状纤维稍为减少，网状纤维在瘤细胞间普遍存在；而网状细胞肉瘤的网状细胞中会产生较多的网状纤维，与网状纤维细胞紧密粘连或自胞浆伸出，分布于每个细胞之间,用于显示和鉴别肿瘤的性质和来源 (4)区分骨尤文肉瘤与骨网状细胞肉瘤 骨尤文肉瘤肿瘤组织区域没有网状纤维，网状

35、纤准只见于血管周围和纤维性骨小梁之间；而骨网状细胞肉瘤在网状纤维染色中，可见细胞间有大量的网状纤维存在,网状纤维染色的应用,网状纤维染色的应用,用于显示和鉴别肿瘤的性质和来源 (5)显示与鉴别骨异质增生与骨化性纤维瘤 用网状纤维染色骨异质增生可显示编织状结构；骨化性纤维瘤用银染色可显示呈平行状结构,网状纤维染色的应用,用于显示和鉴别肿瘤的性质和来源 (6)鉴别脑膜瘤与星形细胞瘤 脑膜瘤来自蛛网膜细胞，用网状纤维染色可见网状纤维散在分布于肿瘤组织中；星形细胞瘤则显示不出网状纤维,用于某些肿瘤的诊断 根据染色所显示的网状纤维多少、分布及走行特点，可用于诊断下列肿瘤， (1)平滑肌肉瘤：细胞之间见大

36、量平行分布的网状纤维。 (2)纤维肉瘤：可见大量网状纤维存在，并且包绕瘤细胞,网状纤维染色的应用,网状纤维染色的应用,用于某些肿瘤的诊断 (3)滑膜肉瘤：其梭形细胞产生网状纤维，但不如纤维肉瘤多，上皮样细胞不产生网状纤维。 (4)恶性神经鞘瘤：在细胞致密区域网状纤维细长而宜，行走在细胞之间，纤维与细胞关系密切，但不包绕细胞,显示与观察基底膜的变化 癌肿时癌细胞不产生网状纤维，癌细胞巢周围绕有网状纤维形成基底膜。肉瘤时，瘤细胞间产生网状纤维，不形成巢，缺乏基底膜。上皮样间叶细胞、间皮或滑膜等可形成细胞梁，也可产生少量网状纤维，不形成基底膜,网状纤维染色的应用,网状纤维染色的应用,用于识别坏死组织

37、的结构 凝固性坏死用HE染色往往成为一片红色的无定形物质，识别不出网状纤维支架的形态。用网状纤维染色，可观察列早期凝固性坏死处的网状支架还保留其特点,用于显示和研究肝组织病变 用网状纤维的染色法，可观察肝脏病变处的网状支架形态，分布特点及其破坏情况，可以判定和研究其病变性质、程度及其发展与转归。例如，探讨亚急性黄色肝萎缩是否向肝硬化演变、转向硬化方面演变则可见到网状支架塌陷，黑色纤细的网状纤维逐渐移行为囊状。新形成之胶原纤维被染成棕色,网状纤维染色的应用,网状纤维染色的注意事项,网状纤维染色方法很多，各种方法的试剂配制和操作方法不同，但在染色中的要求都是严格的。 1)用新鲜蒸馏水(最好用双蒸馏

38、水)配制。 2)所用玻璃器材及载破片均达到化学洁净程度。 3)对已配制好的硝酸银液和氨银溶液，要贮藏冰箱保存待用。 4)在染色过程中用染氨银溶液或者硝酸银液的前后应用蒸馏水沉浸,网状纤维染色的注意事项,5)氯化金调整色和硫代硫酸钠固定的时间不应太长否则会引起纤维褪淡现象。 6)根据诊断需耍，可进行胞核染色和其他纤维套色增染，使色彩更为鲜丽、清晰。 7)脱水后及时封片，不宜在空气中停留时间过长，以免产生色素颗粒,Gomoris法 Godon and sweets法 Wilders法 Foots法 James法,染色方法,固定甲醛溶液、乙醇或其他固定液均可。 试剂配制氨性银溶液(甲液：硝酸银10.

39、2克，蒸馏水100ml。乙液：氢氧化钠3.1克，蒸溜水100ml)。取甲液5ml，滴加氨水至溶解清亮为止。再加入5ml乙液，此时该液突然变为紫黑色，再滴加氨水至清亮为止。补加4滴氨水用蒸馏水补足50ml,Gomori银染色法,染色步骤 1)石蜡切片，脱蜡至水。 2)入9.5高锰酸钾中，至3%硫酸(5ml)5min。 3)自来水洗。 4)2草酸漂洗2次，水洗2min 5)2硫酸铁铵媒染1min。 6)自来水及蒸馏水洗2次,Gomori银染色法,染色步骤 7)入氨性银溶液内1min。 8)蒸馏水洗2次。 9)入20甲醛液中5min。 10)蒸馏水浸洗2次。 11)入0.2氯化金液中2min,Gom

40、ori银染色法,染色步骤 12)2硫代硫酸钠固定2min。 13)自来水洗，蒸馏水洗2次。 14)V.G复染3min。 15)直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。 结果网状纤维灰黑色，胶原纤维红色，基质黄色,Gomori银染色法,结缔组织多色染色法,在组织胚胎学中将结缔组织分为疏松组织、致密组织、网状组织、软骨组织、骨组织和血液等。结缔组织结构上的特征是细胞分散，有大量的细胞间质。结缔组织染色主要以显示或区分各种纤维成分，故又称为纤维性结缔组织多色染色。在病理诊断中，用于判定各种组织、器官和病变程度与修复情况，以不同色调显示与区别某些非结缔组织及物质成分,Masson三色染色法,主要

41、显示核、嗜银颗粒、神经胶质纤维、胶原、角质、细胞问纤维等。 固定此法最好用zenker液或Bouin液固定，10甲醛固定也可，若再用重铬酸钾液处理后也能获得较好的结果,Masson三色染色法,染色步骤 1)切片脱蜡至水，如用zenker液固定 2)Regaud苏木素液染5min。 3)95乙醇中洗2次。 4)在苦昧酸乙醇液中分色。 5)在流水中洗，蒸馏水洗。 6)丽春红酸性复红液中染5min,Masson三色染色法,染色步骤 7)蒸馏水洗。 8)1磷钼酸中染5min。 9)不经水洗，直接人醋酸苯胺蓝液中3min。 10)1醋酸处理1min。 11)95乙醇脱水，无水乙醇脱水多次。 12)二甲苯

42、透明，中性树胶封固,胶原纤维呈蓝色，弹力纤维棕色，肌纤维、纤维素、 红细胞呈红色，胞核呈黑蓝色,第五节 病原体染色,一、细 菌,细菌是最常见的一类病原微生物，是具有细胞壁的单细胞生物。根据染色方法可以把细菌分为一般细菌和抗酸菌两类，这两类细菌在染色方法上是显著不同的,在组织切片上，显示细菌最常用的染色法是Gram氏染色法，依据染色性状不同，把细菌分为两大类 A：Gram氏阳性细菌 B：Gram氏阴性细菌,分枝杆菌有脂性被膜，用Gram氏染色法染色一般不易着色。为了显示这类杆菌，齐一尼氏石碳酸复红是最常用的经典染色方法。杆菌着色后，具有抗盐酸酒精的脱色作用，故又称抗酸性杆菌，这类细菌在病理学检验

43、中最多见的是结核杆菌和麻疯杆菌。 结核杆菌呈单个或平行聚合排列。 麻疯杆菌与结核杆菌相似，但较短粗,细菌染色的应用,细菌在HE染色上不能分类，故须作细菌染色。 一些疑为细菌感染性炎症：可用细菌染色进一步确定病原诊断。如伤寒肉芽肿性炎或葡萄球菌性炎等化脓性炎症的诊断中细菌染色有很重要的诊断价值。 麻风病与结核病：均由菌体表面含蜡质膜的抗酸杆菌所感染形成，故须经抗酸染色才能着色，从而与其它疾病相鉴别,Gram氏染色法,操作方法： 切片常规脱蜡至水。 结晶紫液中染45秒。 自来水洗。 Gram氏碘1分钟。 在碘丙酮中分化(直到切片无色为止,水冲洗。 1%中性红染核1分钟。 自来水速洗。 常规脱水、透

44、明、封固,结果：Gram氏阳性菌呈蓝黑色，Gram氏阴性菌呈红色,抗酸菌染色的应用,根据染色特点将结核杆菌、麻风杆菌通常称为抗酸杆菌。因为结核杆菌和麻风杆菌中含有一种特殊的脂质性包膜，对一些染料有一定的抗拒作用，因此用一般性染料和方法则不易着色；经过特殊的染色处理后，这类细菌一经染上颜色，又不易脱色，所以这类杆菌又称为抗酸杆菌，所用染色方法称抗酸杆菌染色。此类菌在HE中是看不到的，只有经过特染才能观察到细菌是否存在,结核病与类结核病的鉴别 在通常的情况下，有特异病理变化的典型结核不难诊断仍非典型者常需要特殊染色与类结核病鉴别。如结核病用结核杆菌的染色方法时其病灶内可查出抗酸杆菌为阳性反应，而结

45、节病、梅毒、颗粒肿、矽肺、亚急性甲状腺炎等类结核病变均为阴性反应,抗酸菌染色的应用,抗酸菌染色的应用,2)用于麻风病的诊断与鉴别 麻风病变切片用抗酸杆菌染色显示麻风杆菌可确诊为麻风病，并可根据麻风杆菌的数量区分瘤型或类结核型，也可根据抗酸杆菌病变的形态分布特点等进行鉴别,染色注意事项,在显示抗酸杆菌的方法中传统的ZiehlNeelsen法较为普通使用，用染色能力很强的复红作染剂，以石炭酸作媒染剂。为了促进染液穿透，采用加热的方法。细菌着色后用稀酸除去背景染色，最后再用亚甲蓝等复染背景，结果在蓝色的背景上抗酸杆菌呈鲜红色,染色方法,Ziehl-Neelsen抗酸杆菌法 试剂配制 碱性品红酒精饱和

46、液(约5.95%) 10ml 5%石碳酸水溶液 90ml,染色方法,Ziehl-Neelsen抗酸杆菌法 染色步骤 1)切片脱蜡至水。 2)入石炭酸复红掖1h于37C或56温箱内30min。 3)自来水洗。 4)用0.5盐酸乙醇分化。 5)水洗，用0.1亚甲蓝水溶液复染。 6)用95乙醇分化，使亚甲蓝脱色，以便显示清楚。 7)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固,结果抗酸杆菌红色，其他组织呈复染色,二、真 菌,真菌又称霉菌，种类很多，和其他微生物一样，广泛分布于自然界。在人体中有2种基本形态，即单细胞型和多细胞型,真菌染色法的选用,1曲菌 通常HE染色中可见到曲菌，因为曲菌菌丝对苏木素有弱嗜

47、染性，故一般可用高碘酸无色复红法，但也可用醛复红法或六胺银法，效果均较好。这种真菌感染多见于肺部，皮肤、耳、鼻腔、眼眶等,2毛霉菌 形态和曲菌相似。其染色以用六胺银和无色复红、醛复红为佳。人体毛霉菌常见于头面部、肺部和消化道，易侵犯血管，常引起脉管炎、血栓形成和梗死等病变,真菌染色法的选用,真菌染色法的选用,3新型隐球菌 呈圆形或卵圆形，为一种粘多糖物质所组成。爱先蓝(阿尔森蓝)和粘液胭脂红染色呈阳性反应,真菌染色法的选用,4放线菌 是一种有细胞壁，其化学组成与细菌相似的真菌。在HE染色中可见中央菌体呈紫蓝色，菌丝末端带有胶样物质组成的鞘包围而膨大成棒状，嗜染曙红而呈红色。用六胺银染色能把菌丝

48、和胶样鞘都显示出来。主要侵犯人的面颈部、腹部和胸部，也可侵犯肠壁、肝和肺,5白色念珠菌 是一种圆形生芽的酵母样菌。在组织切片内常同时见到孢子和菌丝。孢子和菌丝在HE染色中均呈蓝紫色，用革蓝法或六胺银法染色也呈阳性。本病好发于皮肤、口腔、外明及阴道和呼吸道等,真菌染色法的选用,真菌染色法的应用,真菌引起的病变虽然多种多样，但都不具有特异性，且真菌在HE染色中均显蓝色，故须作真菌染色。 在化脓性炎、坏死性化脓性炎及肉芽组织性化脓性炎或化脓性炎伴有巨细胞反应疑为霉菌感染时，找到霉菌的菌丝、抱子及菌体即诊断为霉菌性炎,Grocott六胺银核固红亮绿法,用铬酸氧化真菌内多糖化合物而暴露醛基，醛基还原六胺

49、银液成为黑色的金属银。氯化金用来调色，把金属银转变为更稳定的金属银，并可排除组织中的黄色色调。硫代硫酸钠液对已显色的银盐起固定作用并除去末反应的银离于对曲菌显示较好。 固定中性甲醛液或Helly液,Grocott六胺银核固红亮绿法,染色步骤 1)切片脱蜡至水。经Helly液固定的组织切片可先脱汞。 2)氧化切片于5铬酸水溶液1h。 3)流水清洗5min。 4)浸人1亚硫酸钠水浴液1min，除掉铬酸。 5)自来水清洗5min,Grocott六胺银核固红亮绿法,染色步骤 6)蒸馏水清洗3次。 7)放人六胺银硼砂液染色lh(于4550温箱内)，切片呈浅棕色为止。在镜下观察，如过染则结缔组织着色太深。

50、 8)蒸馏水洗3次。 9)用0.2氯化金水溶液调色5min,染色步骤 10)蒸馏水洗。 11)固定于2硫代硫酸钠水溶液3min。 12)自来水洗。 13)入核固红染液染细胞核10min。 14)自来水洗，蒸馏水洗,Grocott六胺银核固红亮绿法,Grocott六胺银核固红亮绿法,染色步骤 15)入亮绿染液30秒(或用马休黄液复染) 16)蒸馏水快速稍洗。 17)无水乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封固,Grocott六胺银核固红亮绿法,结果 各种真菌均被着色。菌丝和孢子呈明显的黑褐色，抗酸菌也呈黑褐色，粘液呈紫色，细胞核呈红色,Grocott六胺银核固红亮绿法,注意事项 1)当切片置入六胺银工

51、作液60min时菌体才开始淡淡地显影。因此在60min左右即取出用蒸馏水洗后置镜下观察有否菌体出现，以后每隔10min取出镜检控制为准。 2)在低倍镜下菌体不宜着色太黑，否则在高倍镜下观察时则不够清晰透亮。 3)六胺银溶液都应放入4冰箱中保存为好,Grocott-Gomori氏六胺银改良法,染色方法： 切片脱蜡至水， 入5%铬酸水溶液于60烤箱中作用60分钟。 水洗，蒸馏水水洗。 入六氨银液中浸染60-90分钟。 水洗,Grocott-Gomori氏六胺银改良法,染色方法： 0.1%氯化金处理5分钟。 水洗，蒸馏水洗。 5%硫代硫酸处理5分钟。 水洗。 0.5%淡绿或中性红作对比染色。 常规脱

52、水，二甲苯透明，中性树胶封固,Grocott-Gomori氏六胺银改良法,结果： 新型隐球菌染为深黑色，菌壁四周深黑，中间为空白区，背景为红色；曲菌的孢子和菌丝均被染为深黑色，孢子四周黑色，中间也为一空白区，菌丝呈多结节分布，呈45度角分枝，有的如散花状分布，其它菌丝显示黑色,Grocott-Gomori氏六胺银改良法,注意事项： 该法的主要原理是利用铬酸氧化真菌菌壁的多糖化合物而暴露醛基，醛基将六胺银液中的银还原，成为黑色的金属银。如此，氧化切片成为类键，氧化切片可以有几种不同的方法： 加热法（上述的方法）。 延时氧化法：即将氧化液稀释，配成2%或5%，然后于室温中氧化过夜。 微波加热氧化法

53、：将氧化液连同切片于微波炉中加热氧化10-20分钟,铬酸PAS,染色方法： 石蜡切片2-3微米，脱腊常规至水。 4%铬酸氧化1小时。 流水冲洗5分钟，蒸馏水洗2分钟。 冷雪夫氏(Cold Sohiff)液，15-20分钟。 0.5%偏重亚硫酸钠水溶液5分钟(更换2次,铬酸PAS,染色方法： 水洗5分钟。 蒸馏水洗，至70%酒精洗2分钟。 醛复红染液30分钟。 95%酒精洗(洗去多余染料)。 蒸馏水洗，入淡绿染液30秒钟。 蒸馏水速洗(镜下观察,铬酸PAS,结果： 曲霉菌、念球菌属、细胞浆菌属、隐球菌属为红紫色。曲霉菌丝周边紫红色，弹力纤维紫色，背景绿色,第六节 脂类染色,脂类或脂质是中性脂肪、

54、类脂以及它们的衍生物的总称。脂类的共同物理性质是不溶于水而溶于乙醇、三氯甲烷、乙醚和四氯化碳等有机溶剂,脂类物质在人体中占有相当大的部分，通常它们在人体内以两种形式存在，第一种为脂肪，主要为中性脂肪，储存的部位如皮下，大网膜，肌间肾周围组织等部位，另外一种为结构脂肪，如磷脂、胆固醇等，它们与蛋白、糖类结合在一起存在于细胞内，构成细胞的组成成分,一、脂类染色的应用,在病理检验中，脂类染色法最常用以证明脂肪变性、脂肪栓子以及肿瘤的鉴别。脂类染色使用最广泛的染料是苏丹染料，最常用的有苏丹、苏丹、苏丹黑及油红O等。脂肪被染色，实际上是苏丹染料被脂肪溶解吸附而呈现染料的颜色。经研究认为组织中脂质在液态或半液态时，对苏丹染料着色效果最好。根据这一原理，适当提高温度（37-60）对组织切片染色效果是有好处的,一、脂类染色的应用,心、脑、肾等组织器官的脂肪栓塞，脂肪染色即可判定栓子是否为脂肪滴。 心脏、肝脏等脂肪变性：脂肪染色可显示变性细胞内的脂滴。 脂肪肉瘤与其它间叶组织的恶性肿瘤的鉴别：脂肪染色即可显示脂肪肉瘤瘤细胞内产生的脂滴,一、脂类染色的应用,脂类染色，用冰冻或石蜡切片，以水溶性封固剂封固，如甘油明胶和阿拉伯糖胶等,二、苏丹(Sudan )染色法,操作方法： 固定于10%甲醛的组织。 水洗后采用冰冻或石蜡切片。 经蒸馏水后，浸染于Harris苏木素 或明矾苏木素中淡染1-2分钟。