新城疫病毒F蛋白的裂解位点氨基酸序列多样性及其它区段对细胞膜融合活性的医学影响

1、新城疫病毒F蛋白的裂解位点氨基酸序列多样性及其它区段对细胞膜融合活性的医学影响第一章 新城疫病毒新城疫（Newcastle disease, ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）引起的一种能够感染鸡和多种禽类的急性、高度接触性传染病。以呼吸道和消化道黏膜及浆膜出血、神经紊乱、发热、下痢、呼吸困难等为主要临床症状，是目前危害世界养禽业最严重的烈性传染病之一（Aldous and Alexander 2001; Alexander 2000）。世界动物卫生组织（World Organisation for Animal Health, OIE）将其列为必

2、须报告的动物疫病，我国农业部将其列为一类动物疫病。ND 作为一种常见的地方流行性疫病，自 1926 年，在印度尼西亚的爪哇（Java）和英格兰的滨海小镇新城（Newcastle-upon-Tyne）首次发生新城疫的大流行以来，全球范围内共发生了四次新城疫大流行，给全球养禽业造成了巨大的经济损失（Lomniczi et al. 1998; Munir et al. 2012）。1.1 新城疫病毒概述NDV 是单股、不分节段、含有囊膜的负链 RNA 病毒，属于副粘病毒科（Paramyxoviridae），副粘病毒亚科（Paramyxovirinae），禽副粘病毒属（Avulavirus）（Mayo

3、2002; Yue et al. 2009）。根据血凝抑制（HI）和神经氨酸酶抑制（NI）试验及遗传进化分析，目前，禽副粘病毒属（Avian paramyxovirus, APMV）共包括 15 种血清型，分别命名为 APMV-1 至 APMV-15（Briand et al. 2012; Lipkind et al. 1982; Miller et al. 2010a;Terregino et al. 2013; Thampaisarn et al. 2017; Thomazelli et al. 2017; Yamamoto et al. 2015）。APMV-1 又称 NDV，其是对家禽

4、业危害最为严重的禽副粘病毒（Alexander 2000）。APMV-2 至-15 对鸡或其它禽类也有不同程度的致病性，但危害程度要远远小于 NDV。传统 NDV 对鸡、鸽子、火鸡等表现较高的死亡率，目前已证实至少有 250 余种鸟类可自然或人工感染 NDV（Ababneh et al. 2012）。.1.2 新城疫病毒的分子流行病学目前，针对 NDV 的分子分类主要有两种方法：一是病毒谱系（Lineage），二是基因型（Genotype）。按照基因型分类是目前分析 NDV 分子进化的常用方法。1996 年，Ballagi-Pordány 通过 RT-PCR 法扩增出 200 多

5、株 NDV F 基因第 334-1682位的核苷酸片段并进行测序，对 Hinfl、BstOl、RsaI 这 3 种限制性内切酶的酶切位点分布情况进行分析，据此将 NDV 毒株进行基因分型（Ballagi-Pordány et al. 1996）。后来，随着对 NDV 研究的深入，同样应用 RT-PCR 法扩增出 F 基因的高变区（47-420nt），并绘制能够揭示 NDV 分离株遗传关系的系统发生树，从而确定 NDV 的基因型。经过多年系统的研究，至今采用这种基因分型的方法可将 NDV 分为两大类：即 I 类（Class I）和 II 类（Class II）。其中基于 F 基因片

6、段（374 nt）分析的基础上，Class I 可分为 9 个基因型，但通过对 F 基因全长进行分析的新分类标准，认为只有一个基因型，即基因 I型，但至少可分为 3 个不同的亚型，即 1a，1b 和 1c。同样，Class II 分离株可进一步分为 18 种基因型，其中也包括许多不同的亚基因型（Czeglédi et al. 2006; Diel et al. 2012;Kim et al. 2007; Susta et al. 2015）（表 1-1）。依据 F 蛋白基因完整编码序列分析，Class I与 Class II 病毒株的基因型在遗传上有 41%-46.3%的差异，两

7、者总体距离为 44.2%。ClassI 类分离株在已知所分离的毒株间遗传距离仅存在 5.9%的差异。而 Class II 类分离株基因组间的核酸距离变化较大，其中 F 基因在 7.8%-28.9%范围内变化。值得注意的是，在基因型 XI 和 XIV 间观察到最大的遗传距离是 28.9%，当与其它基因型相互比较时，遗传距离在 12.8-26.6%。在过去十几年间，这两种基因型的病毒仅在有限的区域，如马达加斯加，尼日利亚，贝宁和马里地区分离出来。另外，早期（1930-1960）基因型（I，II，III，IV 和 IX）间的遗传距离小于 14.4%，而这些基因型与晚期（1960-至今）鉴定的基因型（

8、XIII，XIV，XV，XVI，XVII 和 XVIII）间的遗传距离在 15.9-26.6%（Czeglédiet al. 2006）。.第二章 NDV 天然分离株 F 蛋白裂解位点氨基酸序列的多样性NDV F 蛋白是影响其致病性的主要决定因素，它首先被合成无活性的前体蛋白 F0，然后在宿主细胞蛋白酶作用下裂解产生由二硫键连接的两个亚基：F1和 F2，从而表现出融合活性（Rott and Klenk 1988）。蛋白裂解效率主要与宿主细胞的种类和病毒株本身的特点有关（Garten et al. 1980; Nagai et al. 1976a）。一般情况下，强毒株 F 蛋白裂解

9、位点P3 位的谷丙酰胺（Q）两侧有成对碱性氨基酸存在，同时 P1’位为苯丙氨酸（Phenylalanine,F）（Glickman et al. 1988），这种基序能被广泛的宿主细胞蛋白酶识别。相反，弱毒株 F蛋白裂解位点处的二元基序中存在单个碱性氨基酸且 P1’位为亮氨酸（Leucine, L）。它只能被有限的宿主细胞中的蛋白酶所裂解（Collins et al. 1996）。因此，根据 F 蛋白裂解位点氨基酸的变化可以确定该病毒的致病型，即它是弱毒还是强毒（Lomniczi et al. 1998;Seal et al. 1995）。随着自然界中分离 NDV 毒株

10、数量的增多，以及国际上对其 F 蛋白序列的完整测定，使 F 蛋白裂解位点（Fcs）氨基酸序列多样性逐步呈现出来。通过分子遗传进化分析，NDV 被分成了两个不同的分支：Class I 和 Class II（Czeglédi et al. 2006）。Class I 类分离株基因组序列公布的较少，且主要分离自水禽。Class II 类病毒主要分离自家禽、宠物和野生鸟类中（Aldous et al. 2003; Seal et al. 2005）。虽然没有很多文献记载，但已有证据显示低毒力的 NDV 可能演变成强毒型，因为少量点突变足以导致强毒株病毒的出现（Alexander 2011

11、; Collins et al. 1998; Gould et al. 2001）。而在自然界中，引起 NDV 变异的原因较多，如集约化的高密度饲养、不同禽物种种群间的相互感染、疫苗的频繁或不正当接种所引起的免疫选择压力、气候及宿主等因素均可引起病毒新基因型的产生。本研究通过对 NCBI 中已发表的 NDV Fcs 信息进行统计分析，并观察所属毒株的基因型、宿主、地理范围及分离年限等之间的联系，从而为进一步研究 Fcs 氨基酸序列多样性对细胞膜融合活性的影响提供必要的理论依据。2.1 材料与方法2.1.1 数据材料从 GenBank 数据库及之前的文献报道中（Benson et al. 201

12、5; Diel et al. 2012）下载截止 2015 年 8 月上传的 NDV F 基因，共收集到 1590 个序列信息。用软件 Lasergene7.1对 NDV F 蛋白裂解位点氨基酸序列进行统计；利用 Cytoscape-3.4.0 软件绘制宿主与裂解位点氨基酸序列之间的关系图；利用 WebLogo 3.1 软件将 F 蛋白裂解位点每个位置氨基酸的保守信息通过图形表示出来。.2.2 结果对下载的 1590 个 NDV 自然分离株 F 基因序列信息进行统计分析。首先将一些缺乏病原性信息及一些具有非常规氨基酸种类的毒株去除（表 2-1），最终共有 1572 个分离株用于 Fcs 的详细

13、分析。根据这些自然分离株的致病性及强弱毒 Fcs 的判定标准，可将其分为两大类：其中符合中强毒的毒株共有 1073 个，共包含 8 种不同组合的氨基酸序列；剩余的 499 个被认为是弱毒株，共包含 10 种不同组合的氨基酸序列（表 2-2, 2-3）。强毒 F 蛋白裂解位点（Virulent F protein cleavage site, VFcs）氨基酸序列的 8 种类型毒株均属于 NDV Class II 类。其中，裂解位点氨基酸基序为RRQKR↓F;的 VFcs-1 类毒株是含 VFcs 毒株中数量最多的，且几乎包含 Class II 中所有基因型 （除基因 I、III、VI

14、 和 XV 型外）。含有 VFcs-4GRQKR↓F;类的 5 个分离株与 VFcs-7KRKKR↓F;类的一个分离株都属于基因 VI 型。VFcs-3KRQKR↓F;类和 VFcs-5RRKKR↓F;类的毒株出现在均属于强毒的基因 V、VI 和 VII 型中。VFcs-8RRRRR↓F;类的毒株是基因 XI 型所特有的。在所有 VFcs 中，P1’位的氨基酸均是苯丙氨酸（Phe, F），根据 P1 到P5 位氨基酸的特性，进一步将 VFcs 分为两组：第一组为含有多碱性氨基酸组（VFcs-1到 4），第二组则为全碱性氨基酸组（VF

15、cs-5 到 8）。值得注意的是，第一组中 P3 位氨基酸均为谷氨酰胺（Gln, Q）（表 2-1）。弱毒 F 蛋白裂解位点（Avirulent F protein cleavage site,AFcs）氨基酸序列的 10 种类型中，P1 到 P5 位也含有多碱性氨基酸，但 P1’位氨基酸为亮氨酸（Leu, L）（除了 P1’位为 F 的 AFcs-5 类）。在 NDV Class I 和 Class II 中均含有 AFcs 的毒株。其中，含有AFcs-1GRQGR↓L;、 AFcs-2GKQGR↓L;和 AFcs-4ERQER↓L;类的

16、毒株是最为流行的，分别有 143、121 和 156 个分离株。但是含 AFcs-2 类毒株仅存在于 Class II 中，AFcs-4 类毒株则仅在 Class I 中发现。AFcs-8EKQGR↓L;类毒株属于 Class II 中基因 I和 X 型，而 AFcs-9EQQER↓L;类毒株仅存在于 Class I 中。有趣的是，含 AFcs-3、AFcs-5、AFcs-7 和 AFcs-10 类的毒株数量都比较少，且仅存在于 Class II 的基因 I 型中。.第三章 F 蛋白裂解位点氨基酸序列多样性对细胞膜融合能力的影响.263.1 材料.263.2 方法.273.

17、3 结果.343.4 讨论. 463.5 小结. 47第四章 裂解位点氨基酸基序为RRQRR↓L;.484.1 材料.484.1.2 细胞、质粒和毒株.484.2 方法. 484.3 结果.524.4 讨论. 694.5 小结. 71第五章 NDV 致细胞膜融合作用检测方法的初步建立.725.1 材料与方法.725.2 方法.735.3 结果.745.4 讨论. 775.5 小结. 79第五章 NDV 致细胞膜融合作用检测方法的初步建立副粘病毒、疱疹病毒及人类免疫缺陷病毒（HIV）等有囊膜病毒感染宿主细胞的特征之一，就是细胞融合，即形成合胞体（Choppin and Scheid 1

18、980; Hoekstra 1992; Lamb1993）。NDV 是一种禽副粘病毒，感染 NDV 的细胞在其质膜上表达了融合蛋白 F，这一过程使受感染的细胞能够与相邻细胞结合并融合形成合胞体。在 NDV 感染宿主细胞的整个过程中，细胞融合是 NDV 增殖与感染的关键步骤，也是感染宿主细胞的一种典型病理特征，此过程主要由 NDV 囊膜上的 F 和 HN 蛋白协同完成。而细胞融合效率可作为衡量病毒株毒力强弱的标准之一。以往多利用光学显微镜通过直接观察合胞体进行判定：1）依据细胞融合面积判定融合程度为+至+四个级别；2）随机选若干视野，计算合胞体中核的数量，分析融合的细胞数目所占总合胞体数的比例（

19、王志玉. 2001）。前一种方法虽然简便，但比较粗略，只能用于简单的阴性和阳性判断，不能对细胞融合程度进行精确的表示。而后一种也是至今仍然采用的方法，虽比前一种方法先进了一步，但主要是通过人工计数，易出现误差，而且当细胞融合程度很高时，对合胞体中细胞核的数目很难数清楚，因此，也不易对细胞融合程度做出精确测定。流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）的出现为细胞融合效率的定量研究提供了一个方便的工具。荧光报告基因和流式细胞术的结合使用可以快速分析合胞体的数量、大小等。其中在对 HIV 诱导细胞融合效率的研究中，已描述了使用流式细胞术来量化 HIV诱导的合胞体数量（Huerta et al. 2002）。因此，本研究通过慢病毒包装技术筛选出带两种荧光（GFP 和 tRFP）的细胞系，将两