利用四引物扩增受阻突变体系PCR技术检测水稻光温敏核不育基因

1、利用四引物扩增受阻突变体系PCR技术检测水稻光温敏核不育基因p/tms李军李白高荣村(嘉兴市农业科学研究院,浙江嘉兴;通讯联系人,Email:lijunjxcom)DetectionofGenep/tmsforPhotoperiodandThermoSensitiveGenicMaleSterilitybyTetraPrimerAmplicationRefractoryMutationSystemPCRinRiceLIJun,LIBai,GAORongcun(JiaxingAcademyofAgriculturalSciences,Jiaxing,China;Correspondingauth

2、or,Email:lijunjxcom)LIJun,LIBai,GAORongcunDetectionofgenep/tmsforphotoperiodandthermosensitivegenicmalesterilitybytetraprimeramplicationrefractorymutationsystemPCRinriceChinJRiceSci,():Abstract:SpecificprimersweredesignedfortetraprimeramplificationrefractorymutationsystemPCR(ARMSPCR)methodaccordingt

3、othesinglenucleodidemutationingenep/tmsEleventwolinesterilelinesandtwonormalvarietieswereanalyzedbythismethodTheresultscouldclearlydistinguishthegenotypeofp/tms,whichwascompletelyconsistentwiththeresultofCAPsmarkerbasedanalysisTherefore,asalowcost,simpleandreliabletechnique,thismethodcouldbewidelyus

4、edtothep/tmsdetectionandmolecularmarkerassistedbreedinginriceKeywords:rice;PTGMS;p/tms;tetraprimerARMSPCR李军,李白,高荣村利用四引物扩增受阻突变体系PCR技术检测水稻光温敏核不育基因p/tms中国水稻科学,():摘要:根据p/tms基因存在的单核苷酸变异,利用四引物扩增受阻突变体系PCR(TetraprimerARMSPCR)的方法设计特异引物,对个两系不育系水稻品种(或品系)以及个常规稻品系进行扩增.根据其PCR产物带型,可以准确鉴定光温敏核不育基因p/tms的基因型,其检测结果与通过C

5、APS标记检测的结果完全一致.该方法成本低、简单、可靠,可用于p/tms基因的鉴定和分子标记辅助育种.关键词:水稻;光温敏核不育;p/tms基因;四引物扩增受阻突变体系PCR中图分类号:Q;A文献标识码:A文章编号:()水稻是我国乃至世界上最重要的粮食作物之一,通过“两系法”及“三系法”培育杂交水稻新品种、提高水稻产量一直是水稻育种学家的重要目标.自从年石明松在湖北晚粳稻品种农垦群体中发现光敏感雄性不育植株农垦S以来,利用光温敏雄性不育系培育两系法杂交水稻得到了深入发展,一批光敏雄性不育、温敏雄性不育及光温敏雄性不育水稻陆续被发现及培育出来,如玉兔S等光敏雄性不育水稻;安农S、株S、滇寻号及广

6、占S等温敏核不育水稻;培矮S等对光照和温度都有一定敏感性的水稻不育系.与“三系法”相比,“两系法”不需要保持系,在不同光温条件下既可以作为不育系与恢复系杂交制种,又可以自身繁殖,简化了繁种制种程序,降低了杂交种子生产成本,同时恢复源广、配组自由,现已大规模应用于杂交水稻生产,对两系不育系的选育也成为制约“两系法”杂交水稻培育的关键.大量遗传分析表明,水稻光敏核不育(photoperiodsensitivegenicmalesterility,PGMS)和温敏核不育(thermosensitivegenicmalesterility,TGMS)都受单隐性基因控制,如安农S和株S.现已定位的光敏基

7、因有pms、pms及收稿日期:;修改稿收到日期:.基金项目:嘉兴市科技计划资助项目(BY,AZ,BZ).中国水稻科学(ChinJRiceSci),():http:/wwwricescicnDOI:/jissnpms,温敏基因有tms、tms、tms、tms、tms及tms.Zhou等以培矮S和农垦S为材料,克隆了位于第染色体上的一个光温敏核不育主效基因p/tms,该结果与Ding等在农垦S中报道的IncRNA突变位点一致.p/tms是一个非编码RNA基因,在第位发生一个C到G的单碱基替换,降低了小RNA的表达水平以及它与靶基因的互作能力,造成了农垦S光敏及培矮S温敏不育的发生,该单碱基突变为鉴

8、定光温敏核不育系的基因型提供了依据.较常见的单碱基多态性位点检测方法包括测序、高分辨率溶解曲线分析(highresolutionmelt,HRM)、单链构象多态性分析(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)及开发CAPs(cleavedamplificationpolymorphismsequencetaggedsites)标记等方法,但这些方法检测过程繁琐、检测时间长、费用高,不利于广泛推广应用.四引物扩增受阻突变体系PCR(tetraprimerARMSPCR)是一种在普通PCR基础上发展起来的、专门用于检测SNP的技术,对单核苷酸突变检测具有

9、快速、简便、费用低等特点,可以区分等位基因是否纯合,现已在水稻低直链淀粉含量基因、稻瘟病抗性基因及米香基因等的SNP检测中得到广泛应用.水稻光温敏核不育基因p/tms的检测及分子标记辅助育种等方面的报道较少.李丁等根据p/tms突变位点设计CAPS标记并对农垦S等光温敏核不育系进行了检测,但由于检测过程中涉及到限制性内切酶的使用,在实际应用中存在费用高、操作繁琐等弊端.本研究根据Ye等创制的四引物扩增受阻突变体系PCR来检测SNP突变位点的方法,检测水稻光温敏核不育基因p/tms,旨在建立快捷、准确的检测方法来鉴定p/tms的不同基因型,为利用p/tms的分子标记辅助选择育种提供一种经济可靠的

10、检测方法.材料与方法水稻材料供试水稻材料包括个两系不育系水稻品种(或品系)农垦S、培矮S、S、广占S、新二S、YS、矮占S、NCS、S、深S及CS;个常规稻品系D和A.上述所有材料于年夏季催芽,取g幼苗叶片,参照Murry等的CTAB方法提取叶片总DNA.引物的设计及合成根据水稻光温敏核不育基因p/tms在第位碱基由C到G的变异(图A),以及已经公布的基因序列(NCBI登录号JQ),参照Ye等的方法和在线引物设计软件(http:/cddargeneticssotonacuk/public_html/primer)设计引物(表).ARMSPCR引物由两条外侧引物和两条内侧引物构成,为了增强引物的

11、特异性,两条内引物分别在端的第位和第位碱基处分别引入一个人为错配,扩增片段大小分别为bp、bp及bp(图B).CAPS标记引物设计根据第位碱基由C到G的变异之后造成该位点AccI限制性内切酶识别位点的变化,由两条外侧引物构成,引物序列同ARMSPCR四条引物中的两条外侧引物,扩增片段大小为bp,酶切片段分别为bp和bp(图C).PCR扩增及检测ARMSPCR反应体系如下:PCR缓冲液L;dNTPL;mol/LPTGMSF引物L;mol/LPTGMSF引物L;mol/LPTGMSR引物L;mol/LPTGMSR引物L;样品DNAL;rTaq(TaKaRa)L;ddHOL.反应程序如下:下预变性m

12、in;下变性s,下退火s,下延伸min,共个循环;下延伸min;下保温min.PCR产物在琼脂糖凝胶上V电泳min后拍照记录.用于p/tms的CAPS标记检测PCR反应体系如下:PCR缓冲液L;dNTPL;mol/LPTGMSF引物L;mol/LPTGMSR引物L;样品DNAL;rTaq(TaKaRa)L;ddHOL.反应程序如下:下预变性min;下变性s,下退火s,下延伸min,共个循环;下延伸min;下保温min.PCR产物酶切p/tms的CAPS标记检测需采用AccI李军等:利用四引物扩增受阻突变体系PCR技术检测水稻光温敏核不育基因p/tms(TaKaRa)限制性内切酶对PCR产物进行

13、酶切.酶切反应体系如下:PCR产物L;mol/L缓冲液L;AccI(U/L)L;ddHOL,总体积L.下酶切h,酶切产物在琼脂糖凝胶上V电泳min后拍照记录.结果与分析对个两系不育系水稻品种(或品系)及个常规稻水稻品系的DNA进行四引物ARMSPCR扩增检测光温敏不育基因p/tms,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳可显示两种类型的条带(图A).为检验该标记在杂合状态下的检测结果,使用了个混合模板(S和常规稻D的DNA等量混合)及个杂合单株作为PCR扩增模板.结果(图A)表明,除ddHO空白对照以外,个样品均检测到bp的条带,该条带为外侧引物PTGMSF和PTGMSR的扩增产物,可检测所有的DNA是否得

14、到有效扩增.农垦S、培矮S、S、NCS及S共个样品检测到bp和bp两条带,该bp的条带为内侧引物PTGMSF和外侧引物PTGMSR的扩增产物,特异扩增第位核苷酸为G的等位位点,表明农垦S、培矮S、S、NCS及S含有等位基因p/tms.广占S、新二S、YS、矮占S、常规稻D、常规稻A、深S及CS共个样品检测到bp和bp两条带,该bp的条带为外侧引物PTGMSF和内侧引物PTGMSR的扩增产物,特异扩增第位核苷酸为C的等位位点,表明该个样品含有等位基因p/tms.另外,在混合模板及杂合单株中都检测到bp、bp及bp三条带,表明该方法对杂合植株也能进行有效检测.为了检验四引物ARMSPCR对该位点单

15、碱基变异检测的准确性,我们对相同的个样品通过CAPS标记的检测方法进行了检测.结果(图B)表明,四引物ARMSPCR的检测结果与通过CAPS标记检测方法完全一致.将PCR产物通过AccI限制性内切酶进行酶切,农垦S、培矮S、S、NCS及S共个样品检测出bp一条带,表明含有光温敏核不育基因p/tms;广占S、新二S、YS、矮占S、常规稻D、常规稻A、深S及CS共个样品检测到bp和bp两条带,表明不含光温敏核不育基因p/tms;混合模板及杂合单株中检测到bp、bp及bp三条带,表明含有杂合基因.因此,通过四引物ARMSPCR方法可以快速、准确鉴定p/tms的不同基因型,达到分子标记辅助育种的目的.

16、表p/tms的ARMSPCR检测引物序列TableTheprimersequencesofARMSPCRforp/tmsdetection引物名称Primer引物序列()Sequence()PTGMSFCTTGCTACCACAAGCTTTCCPTGMSFAGCAAAGAAGTGCATTGTTTGCGTPTGMSRTCCTTCTGGACTAGGAGCAAPTGMSRAAATTTTACTCTTGATGGATGGTGGA等位基因p/TMS与p/tms序列差异;BARMSPCR引物设计;CCAPS标记引物设计.A,Sequencecomparisonofp/TMSandp/tms;B,Primerde

17、signforARMSPCRassay;C,PrimerdesignforCAPSmarkerdetection图水稻光温敏核不育基因p/tms的四引物ARMSPCR检测体系及CAPS标记检测引物设计原理FigPrimerdesignfortetraprimerARMSPCRassayandCAPSmarkerdetectionofricephotoorthermosensitivegenicmalesterilitylocusp/tms中国水稻科学(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)MDNA分子量标准;泳道分别为ddHO空白对照、(p/tms)/(p/TMS)杂合单株、混合模板、农垦

18、S、培矮S、S、广占S、新二S、YS、矮占S、常规稻D、常规稻A、NCS、S、深S和CS.M,DNAmarker;Lanesto,ddHO,(p/tms)/(p/TMS)heterozygote,mixedtemplatewithSandD,NongkenS,PeiaiS,S,GuangzhanS,XinerS,YS,AizhanS,conventionalvarietyD,conventionalvarietyA,NCS,S,ShenSandCS图四引物ARMSPCR及CAPS标记检测不同水稻品种(或品系)p/tms基因型FigMoleculardetectionbasedontetrapr

19、imerARMSPCRandCAPSmarkerfordifferentricevarietiesorlines讨论现有的水稻两系不育系的选育,通常是在田间自然条件下鉴定不育单株.但是,光温条件在我国南北各地及不同季节存在很大差别,一定程度上制约了水稻两系不育系的选育.在海南、广东等地由于日照较短,光敏不育水稻一般不表现雄性不育,较难开展光敏不育系的选育.在长江流域及北方稻区,可进行光温敏不育水稻的选育,但是选到的不育株需要将稻桩移栽到海南等短日照地区或者通过在温室条件下控温控光来获得种子,不但费时费力,而且严重制约可选择群体的大小.同时,目前广为应用的“培矮S”等不育系存在一个明显的问题,即

20、随着种植时间的增加,该品种的“不育起点温度”逐年增加,给育种带来了很大的风险,而导致这一问题的原因尚不清楚.因此,根据已经克隆的水稻光温敏核不育基因开发简单、可靠的检测方法对于水稻两系不育系的选育非常重要.本研究根据已克隆的水稻光温敏核不育基因p/tms的SNP突变位点,建立了一套四引物扩增受阻突变体系PCR检测技术.通过检测发现农垦S、培矮S、S、NCS及S含有等位基因p/tms,而广占S、新二S、YS、矮占S、深S及CS这个两系不育系未检测到p/tms光温敏核不育基因,这与李丁等对农垦S、培矮S及YS的研究结果一致.广占S及YS等不含p/tms基因的两系不育系的不育性可能受不同基因控制.该

21、技术通过一次常规PCR和电泳分离即可通过带型来区分p/tms基因的基因型,检测结果与通过CAPS标记检测方法的一致,具有快速、准确的特点,便于推广应用到水稻光温敏不育系的分子标记辅助选择育种中,提高选择效率,扩大选育群体,缩短不育系选育周期.通过本研究可对现有水稻育种应用中的常用两系不育系进行检测,并使用该方法对含有p/tms基因的两系不育系开展分子标记辅助选育.另外,该方法还有助于将两系不育基因像抗稻瘟病基因、抗虫基因、抗白叶枯病基因等通过分子标记选育聚合在一个水稻品种中,将不同的两系不育基因聚合在一个不育系中,提高不育系的稳定性.参考文献:赵海军,吴殿星,舒庆尧,等携带白化转绿型叶色标记光

22、温敏核不育系玉兔S的选育及其特征特性中国水稻科学,():邓华凤,舒福北,袁定阳安农S的研究及其利用概况杂李军等:利用四引物扩增受阻突变体系PCR技术检测水稻光温敏核不育基因p/tms交水稻,():杨远柱,唐平徕,杨文才,等水稻广亲和温敏不育系株S的选育及应用杂交水稻,():蒋义明滇型杂交水稻温敏雄性不育研究快报云南农业大学学报,():杨振玉,张国良,张从合,等中籼型优质光温敏核不育系广占S的选育杂交水稻,():罗孝和,邱趾忠,李任华导致不育临界温度低的两用不育系培矮S杂交水稻,():YangQK,LiangCY,ZhuangW,etalCharacterizationandidentifica

23、tionofthecandidategeneofricethermosensitivegenicmalesterilegenetmsbymappingPlanta,:杨远柱,符辰建,胡小淳,等株S温敏核不育基因的发现及超级杂交早稻育种研究中国稻米,():ZhangQ,ShenB,DaiX,etalUsingbulkedextremesandrecessiveclasstomapgenesforphotoperiodsensitivegenicmalesterilityinricePNAS,():MeiM,ChenL,ZhangZ,etalpmsisthelocuscausingtheorigi

24、nalphotoperiodsensitivemalesterilitymutationofNongkenSSciChinaSerC:LifeSci,():WangB,XuW,WangJ,etalTaggingandmappingthethermosensitivegenicmalesterilegeneinrice(OryzasativaL)withmolecularmarkersTheorApplGenet,():LopezM,ToojindaT,VanavichitA,etalMicrosatellitemarkersflankingthegenefacilitatedtropicalTGMSricelinedevelopmentCropSci,():SubudhiPK,BorkakatiRP,VirmaniSS,etalMolecularmappingofathermosensitivegeneticmalesterilitygeneinriceusingbulkedsegregantanalysisGenome,():DongN,SubudhiP,LuongP,etalMolecularmappingofaricegeneconditioningthermosensitivegenicmalesterilityusingAFLP,RFLPandSSR