牛囊胚两步法玻璃化冷冻管内解冻方法的优化及其原理初步分析

1、牛囊胚两步法玻璃化冷冻管内解冻方法的优化及其原理初步分析牛胚胎程序化冷冻已广泛应用于生产当中, 冷冻程序较统一 , 技术相对成熟。玻璃化冷冻是继程序化冷冻之后发明的一种简单高效的冷冻方法, 细胞无需经历缓慢的程序化降温过程 , 在玻璃化液中短暂处理后直接投入液氮冷冻即可。该方法不需要昂贵的程序化冷冻仪, 操作省时 , 节约资金。牛胚胎玻璃化冷冻虽有大量的研究报道 , 但冷冻方案多种多样 , 极不统一 , 较大程度上限制了该方法的推广。首先 , 解冻程序不统一 , 研究者对分步解冻与一步解冻各执己见, 没有提出明了的解析 , 让生产者无从参考：其次, 细胞在玻璃化液中的处理时间不确定, 预处理时

2、间从 1min 至 20min 均有报道 , 玻璃化液中的处理时间从30s 至 3min 均有采用。处理时间范围如此宽泛, 不便于生产者参考。牛卵母细胞是研究抗冻保护剂渗透的理想半透膜模型, 本研究以 MII 期牛卵母细胞为模型 , 从原理上分析了抗冻保护剂的添加与脱除之间的关系, 以及处理时间与胞内抗冻保护剂浓度的关系。并将结论用于优化牛囊胚两步法玻璃化冷冻和管内解冻 , 以期简化和统一牛胚胎玻璃化冷冻方法, 为指导生产提供依据。实验结果表明： (1) 用蔗糖浓度较高的玻璃化液处理牛卵母细胞后可采用较低浓度的蔗糖溶液甚至DPBS脱毒。实验 3.1 中, 牛卵母细胞经过 EG20(20%v/v

3、乙二醇的 DPBS溶液 ) 预处理 3min, 分别移入 ES1(40%v/v乙二醇 +0.3M蔗糖的 DPBS溶液 ) 或 ES3(40%v/v 乙二醇 +0.8M 蔗糖的 DPBS溶液 ) 中处理 30s。ES1组以 DPBS、0.25M 蔗糖、0.5M 蔗糖脱毒后的存活率分别为3.33%、56.67%和 76.67%；而 ES3组脱毒后的存活率分别为 56.67%、83.33%和96.67%。(2) 实验 3.2 中 , 牛囊胚经 EG20预处理 3min 后, 分别以 EG40(40%v/v乙二醇的 DPBS溶液 ) 、 ES1、ES2(40%v/v 乙二醇 +0.5M 蔗糖的 DPB

4、S溶液 ) 或 ES3处理 30s, 均采用DPBS脱毒 , 脱毒后各组胚胎再扩张率分别为90.32%、93.33%、 86.60%、75.00%。表明采用 EG作为抗冻保护剂处理牛囊胚后, 即使玻璃化液中不添加蔗糖, 也可以用 DPBS直接脱毒 ;(3) 实验 4.1 中, 当卵母细胞经过 EG20处理 5min,EG40 处理 30s 后 , 将其移入 Gly30(30%v/v 甘油的 DPBS溶液 ) 和 Gly40(40%v/v 甘油的DPBS溶液 ) 中时可以观察到卵母细胞体积膨胀, 表明经过两步 EG处理后胞内 EG的摩尔浓度高于胞外Gly40 的摩尔浓度 (5.6M) ；(4)

5、实验 4.2,4.3中, 经公式计算与实验验证 , 表明 , 牛卵母细胞经 EG20处理 5min, 在 EG40中(EG 浓度为 7.2M) 体积收缩至 0.5V 时( 约 30s) 胞内的 EG浓度为 6.9M, 体积恢复至 0.75V 时胞内的 EG浓度为 7.1M；实验 4.4 中卵母细胞经过EG20处理 5min, 在 ES3中处理 30s 时,经计算胞内的 EG浓度为 7.55M；(5) 实验 4.5 中, 卵母细胞经过 EG20处理 5min,移入 Gly50 中处理 30s 直接投入液氮冷冻 , 获得了 81.08%的存活率和孤雌激活后19.96%的囊胚发育率。该两步法中, 第

6、一步采用 EG预处理 , 第二步采用了渗透性较差的甘油作为玻璃化液, 说明两步法玻璃化冷冻方案中, 如果采取了合适的预处理 , 第二步抗冻保护剂渗入胞内是不必要的, 细胞在玻璃化液中仅需要一个脱水的过程即可； (6) 实验 5.1 中, 采用 EG20为预处理液 ,EFS1 液(40%v/v 乙二醇+18%Ficoll+0.3M 蔗糖的 DPBS溶液 ) 为玻璃化液冷冻牛囊胚 , 其中 EG20预处理3min 组冷冻解冻后囊胚存活率显著高于预处理5min 组(79.41%vs.71.42%,P<0.05)。说明冷冻牛囊胚时采用EG20预处理 3min 即可达到较好的渗透效果；(7) 将预

7、处理确定为 EG20处理 3min, 实验 5.2 中, 分别采用 EFS1、 EFS2(40%v/v 乙二醇 +18%Ficoll+0.5M 蔗糖的 DPBS溶液 ) 、 EFS3(40%v/v乙二醇 +18%Ficoll+0.8M蔗糖的 DPBS溶液 ) 或 EFS4(35%v/v乙二醇 +18%Ficoll+0.5M 蔗糖的 DPBS溶液 ) 液冷冻保存牛囊胚 , 当蔗糖浓度由 0.3M (EFS1 液) 提高至 0.5M 时(EFS2 液), 冷冻解冻后囊胚再扩张率有所提高(80.65%vs.83.33%), 但差异不显著 (P>0.05)。当玻璃化液中的蔗糖浓度提高至0.8M 时(EFS3 液) 胚胎解冻后存活率显著降低(19.44%,P<0.01),说明玻璃化液中蔗糖浓度较高时会使玻璃化液的毒性增加。当玻璃化液中的蔗糖浓度较高时(0.5M), 将其中 EG浓度降低至 35%(EFS4液),获得了较理想的冷冻效果(90.00%,P<0.05)。结论：采用 EG作为抗冻保护剂处理牛囊胚后 , 允许直接采用 DPBS脱毒。经过合适的预处理后 , 细胞在第二步玻璃化液中仅需要