猪牙皂皂苷抗肝癌作用机制的研究及其微球制剂的制备

1、猪牙皂皂苷抗肝癌作用机制的研究及其微球制剂的制备目的 : 本课题通过国内外文献调研和药理实验研究发现我国传统中药猪牙皂具有明显的抗肿瘤作用 , 其主要活性成分是三萜皂苷类化合物1-6。在前期研究的基础上 , 本课题拟采用中药化学分离、纯化和药理实验相结合的活性跟踪法制备猪牙皂皂苷, 通过药理实验探讨猪牙皂皂苷（SFGS）是否具有抗肿瘤作用以及是否具有对索拉非尼的化疗增敏作用, 并阐明其可能的药理作用机制。由于猪牙皂皂苷气味辛辣, 对人体黏膜有一定刺激性, 为方便猪牙皂皂苷的临床应用 , 本课题考虑以壳聚糖为载体材料制备猪牙皂纳米微球, 并进行表征测定和药效学评价。方法 : 试验一猪牙皂皂苷类化

2、合物的分离纯化及抗肝癌活性研究 1. 进行猪牙皂总皂苷提取方法的研究 , 考察各单因素（提取方法和提取溶剂）对猪牙皂总皂苷提取率的影响。2. 称取 50 g 猪牙皂 , 制备总浸膏 , 用大孔吸附树脂法分离纯化 , 通过皂苷的检识反应和体外抗肝癌药理实验 , 进行活性部位的筛选。 3. 称取 29 kg 猪牙皂 , 按照优化后的提取工艺制备猪牙皂总浸膏 , 并用大孔吸附树脂法分离纯化。根据预实验结果 , 选取药理活性最好的洗脱部位 , 用硅胶柱层析法分离纯化（洗脱剂为二氯甲烷 - 甲醇溶剂体系）, 并对各洗脱部位进行体外抗肝癌活性筛选。4. 选取药理活性最好的硅胶柱洗脱部位 , 用 MCI柱层

3、析法分离纯化（洗脱剂为乙醇 - 水溶剂体系） , 并对各洗脱部位进行体外抗肝癌活性筛选。5. 选取药理活性最好的 MCI 柱洗脱部位 , 进行质谱分析 , 对里面的成分进行结构鉴定 , 然后用紫外分光光度法测定皂苷含量。试验二猪牙皂皂苷与索拉非尼联用抗肝癌药理作用机制的研究 1. 通过体外抗肝癌药理实验验证猪牙皂皂苷与索拉非尼联用是否具有协同增效作用。用免疫印迹法（ Western Blot,WB ）法检测在不同给药情况下, 肝癌细胞中凋亡相关蛋白（ cleaved caspase-3、 cleaved caspase-9）的表达水平。 2. 通过WB法检测内质网应激（ ERS）相关蛋白（ G

4、RP78、CHOP）的表达水平 , 验证猪牙皂皂苷是否能够激活肝癌细胞的ERS。通过体外抗肝癌药理实验和WB法检测 ERS是否能够影响猪牙皂皂苷对索拉非尼的化疗增敏作用。 3. 通过 WB法检测 Wnt/-Catenin信号通路相关蛋白（ GSK-3、-catenin 、TCF-4）的表达水平 , 验证猪牙皂皂苷是否能够抑制 Wnt/ -Catenin 信号通路。用 -Catenin 特异性抑制剂（ XAV939）处理肝癌细胞并进行相关检测, 验证抑制 Wnt/ -Catenin信号通路是否能够诱导肝癌细胞凋亡。4. 通过体外抗肝癌药理实验和 WB法验证猪牙皂皂苷是否通过激活ERS介导 Wnt

5、/ -Catenin 信号通路。用内质网应激激活剂（ Thapsigargin,TG ）处理肝癌细胞并进行相关检测,验证 ERS是否能够介导 Wnt/ -Catenin信号通路。 5. 建立 H22荷瘤小鼠模型 ,验证猪牙皂皂苷与索拉非尼联用的体内抗肿瘤作用。试验三壳聚糖 - 猪牙皂皂苷纳米微球的制备及抗肿瘤作用研究1. 选择壳聚糖 - 猪牙皂皂苷纳米微球的制备方法 , 并进行纳米微球制备工艺的研究 , 以外观、粒径、 PDI、 Zeta 电位和包封率为评价指标 , 考察各单因素对纳米微球剂型的影响。 2. 制备壳聚糖 - 猪牙皂皂苷纳米微球并进行表征测定。3. 建立 H22 荷瘤小鼠模型 ,

6、 验证壳聚糖 - 猪牙皂皂苷纳米微球与索拉非尼联用的体内抗肿瘤作用。结果 : 试验一猪牙皂皂苷类化合物的分离纯化及抗肝癌活性研究 1. 经过比较 , 提取溶剂为 75%乙醇 , 提取方法为加热回流法时, 猪牙皂皂苷的提取率最高。2. 通过泡沫试验和醋酐 - 浓硫酸反应 , 可知皂苷类化合物主要存在于大孔吸附树脂柱的 30%乙醇洗脱部位和 70%乙醇洗脱部位 , 且皂苷的主要类别为三萜皂苷。通过体外药理实验 , 证明 70%乙醇洗脱部位的抗肝癌活性最好。3. 通过体外药理实验 , 可知硅胶柱的二氯甲烷 - 甲醇（ 2:1 ）洗脱部位抗肝癌活性最好。 4. 通过体外药理实验 , 可知 MCI 柱的

7、 60%乙醇洗脱部位的抗肝癌活性最好。5. 将 MCI柱的 60%乙醇洗脱部位进行质谱检测 , 通过结构分析 , 鉴定了 17 个三萜皂苷类化合物 , 然后通过香草醛 - 高氯酸显色法测定皂苷含量 , 可知皂苷含量为 77.4 2.1%。试验二猪牙皂皂苷与索拉非尼联用抗肝癌药理作用机制的研究1. 通过体外抗肝癌药理实验 , 可知猪牙皂皂苷与索拉非尼联用组的抗肝癌药理活性均高于索拉非尼同等剂量单用组。此外 , 猪牙皂皂苷与中剂量索拉非尼（ 20M/mL）联用组的抗肝癌药理活性高于高剂量索拉非尼（ 30M/mL）单用组的抗肝癌药理活性。检测肝癌细胞中cleaved caspase-3 蛋白、 cl

8、eaved caspase-9 蛋白表达水平 , 猪牙皂皂苷和索拉非尼联用组要高于SFGS或索拉非尼单用组。2. 猪牙皂皂苷能够激活肝癌细胞的 ERS,上调肝癌细胞中 ERS相关蛋白 GRP78和 CHOP的表达水平。 ERS能够影响猪牙皂皂苷对索拉非尼的化疗增敏作用 : 在体外药理实验中 , 内质网应激抑制剂（ TUDCA）能够显著降低 SFGS和索拉非尼联用组的细胞增殖抑制率和细胞凋亡率 ; 检测肝癌细胞中 cleaved caspase-3 蛋白、cleaved caspase-9蛋白表达水平 ,TUDCA、SFGS和索拉非尼联用组要低于SFGS和索拉非尼联用组。3. 猪牙皂皂苷能够抑制

9、 Wnt/ -Catenin 信号通路 , 上调肝癌细胞中 GSK-3的表达水平 , 下调 -catenin 、TCF-4 的表达水平。抑制 Wnt/ -Catenin 信号通路能够诱导肝癌细胞凋亡 : 在体外药理实验中 ,XAV939能够显著提高肝癌细胞的凋亡率 ; 通过 WB法检测发现 ,XAV939能够下调 -catenin 、TCF-4 的表达水平。4. 猪牙皂皂苷可通过激活 ERS介导 Wnt/-Catenin 信号通路 : 用猪牙皂皂苷分别处理 CHOPsiRNA转染前后的肝癌细胞 , 未转染肝癌细胞的 -catenin 、TCF-4的表达水平低于转染处理后的肝癌细胞; 在体外药理

10、实验中 , 将猪牙皂皂苷和索拉非尼联用分别处理CHOPsiRNA 转染前后的肝癌细胞 , 未转染的肝癌细胞凋亡率高于转染后的肝癌细胞。 用 TG代替猪牙皂皂苷进行同样的验证, 所得到的结果与猪牙皂皂苷基本一致 , 证明 ERS能够介导 Wnt/-Catenin信号通路。5. 通过体内抗肝癌药理实验 , 可知猪牙皂皂苷与索拉非尼联用组的平均瘤重大于索拉非尼同剂量单用组 , 两者有显著性差异。试验三壳聚糖 - 猪牙皂皂苷纳米微球的制备及抗肿瘤作用研究 1. 采用离子交联法制备壳聚糖 - 猪牙皂皂苷纳米微球的最佳工艺处方 : 壳聚糖浓度为 2.0 mg/mL; 三聚磷酸钠浓度为 1.5 mg/mL;

11、投料质量比为 4:1 。2. 对制备的壳聚糖 - 猪牙皂皂苷纳米微球进行表征测定 : 通过电镜观察可知所制备的纳米微球为类球形颗粒 , 大小分布较为均匀 ; 粒径仪测得的 PDI 为 0.183,粒径为 184.7 nm,Zeta 电位为 26.3 mV; 载药量为 14.64%, 包封率为 84.17%;24 h的总释放量为 91.3 5.4%（n=3）。3. 通过体内抗肝癌药理实验, 可知壳聚糖 - 猪牙皂皂苷纳米微球与索拉非尼联用组的平均瘤重小于索拉非尼同剂量单用组, 两者有显著性差异。猪牙皂皂苷纳米微球与猪牙皂皂苷的裸药相比, 前者对索拉非尼的作用要更为明显。结论 : 猪牙皂皂苷与索拉非尼联用时, 能够显著提高索拉非尼的抗肝癌作用 , 可以作为索拉非尼的化疗增敏剂 , 在维持疗效不变的情况下 , 通过减少给药剂量来降低索拉非尼的毒副作用及减轻耐药性。对猪牙皂皂苷抗肝癌药理作用机制的研究表明 : 猪牙皂皂苷可能是一种天然的内质网应激激活剂 , 通过上调 GSK-