猕猴桃、枣高效再生体系的建立及农杆菌介导的遗传转化研究

1、猕猴桃、枣高效再生体系的建立及农杆菌介导的遗传转化研究猕猴桃 (Actinidia)果实风味独特 , 营养丰富 , 被誉为“水果之王” 。枣(Zizyphus jujuba Mill.)是我国第一大干果树种。猕猴桃属雌雄异株 , 遗传背景复杂；枣花蕾小、自然坐果率低、胚败育率高等因素 , 传统杂交育种方法存在周期长、效率低等问题, 获得优质多抗的猕猴桃、枣新品种困难重重。 基因工程的发展为猕猴桃、 枣的育种工作开辟了一条新的途径。本研究以河南特异红果肉猕猴桃资源中华猕猴桃伏牛95-2 (Actinidiachinensis Funiu95-2 ) 为材料 , 建立了中华猕猴桃伏牛95-2 高效

2、再生体系、遗传转化体系 , 且获得了转抗菌肽D基因的转基因植株 ,PCR检测、 Southern杂交检测证明外源基因已整合到猕猴桃基因组中。灰枣遗传转化研究, 本试验以灰枣 (Zizyphus jujubaHuizao ) 为材料建立了灰枣组培快繁体系、叶片直接再生体系及对灰枣遗传转化进行了初步探讨。主要结果如下： 1. 以中华猕猴桃伏牛95-2 叶片为外植体 , 探讨了不同植物生长调节物质对叶片再生不定芽增殖及生根的影响, 建立了高效的再生体系。结果表明 , 叶片外植体在 MS+ZT1.0mg/L+NAA0.3mg/L 培养基上 , 不定芽分化率最高为 87.5%；在 MS+ 6-BA 2.

3、0 mg/L+NAA0.5mg/L 培养基中 , 不定芽增殖系数最高为 4.2 ；适宜不定芽生根培养基为 1/2MS+NAA2.0mg/L,生根率为 100%。2. 以中华猕猴桃伏牛 95-2 叶片为外植体 , 研究了抗生素对外植体生长的影响。结果表明 , 中华猕猴桃伏牛 95-2 对卡那霉素较敏感 , 浓度 20mg/L 时愈伤组织及不定芽分化率均为 0,20mg/L 为中华猕猴桃伏牛 95-2 叶片遗传转化时筛选最佳浓度；生根培养基中附加30mg/L 卡那霉素时 , 则完全抑制根的形成。头孢霉素和羧苄青霉素对中华猕猴桃伏牛95-2 叶片分化均有抑制作用 ,但头孢霉素对叶片分化的抑制作用比羧

4、苄青霉素小；结合遗传转化中的抑菌试验,选用 400mg/L 头孢霉素为中华猕猴桃伏牛95-2 遗传转化中适宜抑菌抗生素及浓度。 3. 以中华猕猴桃伏牛95-2 叶片作为根癌农杆菌介导的受体材料, 建立了高效遗传转化体系。结果表明 , 叶片预培养 3 天, 菌液浓度 OD600值为 0.3, 真空渗入方式侵染10min, 共培养 4 天条件下 ,GUS基因瞬时表达率最高 , 达到 92.2%。对转基因抗性植株进行 PCR检测和 GUS组织化学染色 , 初步证明外源基因已整合到中华猕猴桃 伏牛 95-2 的基因组中。4. 以中华猕猴桃伏牛 95-2 叶片为外植体进行遗传转化 , 对共培养后抗性芽的

5、筛选方式进行了研究 , 并对获得的转抗菌肽 D 基因的抗性植株进行了分子生物检测。结果表明 , 逐步提高卡那霉素选择压力与保持卡那霉素选择压力不变相比 , 抗性芽获得率提高了 28.4%；部分抗性植株经 PCR、PCR-Southern、Southern杂交检测 , 外源基因已整合至猕猴桃基因组中。5. 以灰枣一年生枣头茎段为材料 , 对启动培养时抗生素对污染的抑制 , 不同植物生长调节物质对茎段启动、 不定芽增殖及生根的影响进行了研究。 结果表明 ,大田采样时 , 以 70%酒精灭菌 30s, 再以 0.1%HgCl2 灭菌 1015min 后污染率依然高达 97.8%；培养基中添加150m

6、g/L 或 200mg/L头孢霉素可使污染率降为0；茎段接种于 MS+KT 2.0 mg/L+NAAO.lmg/L培养基中获得的粗壮枣头较多。茎段萌发的腋芽接种于Ms+KT2.0 mg/L+NAA0.3 mg/L 培养基中 , 枣苗长势壮、叶片大、叶深绿；而接种于Ms+6-BA2.0 mg/L+NAA0.3 mg/L 培养基中 , 组培苗较弱 , 增殖系数较高为2.7 。将继代增殖的再生芽接种在生根培养基上诱导生根, 最佳的生根培养基为1/2MS+NAA0.5mg/L,培养 40d 时生根率达 95.56%。6. 以灰枣组培苗叶片为材料 , 研究了不同叶片来源、碳源、叶片放置方式、暗培养时间、

7、乙烯抑制剂等处理对叶片再生的影响。结果表明 , 叶片直接再生不定芽的适宜培养基为 WPM +TDZ 0.5mg/L+NAA0.2mg/L；最佳叶片来源为灰枣组培苗中部平展 , 大而厚叶片；近叶柄处再生率比近叶尖处高 59.74%；以远轴面接触培养基叶片再生率较高为 69.61%；蔗糖浓度为 40g/L 可降低再生芽的玻璃化程度；叶片暗培养时间以 10d 叶片再生率较高为 81.6%；0.5mg/L AgNO3和 0.1 mg/L的 STS均提高了灰枣叶片再生率 , 再生率分别为 82.25%,91.26%。7. 以灰枣叶片为受体 , 研究了卡那霉素对叶片再生的影响、头孢霉素的抑菌效果及不同共培养时间对转化率的影响。结果表明 , 当灰枣叶片再生培养基中添加 40mg/L 卡那霉素能抑制不定芽的分化 ,40mg/L 为灰枣遗传转化中的临界浓度；不同头孢霉素抑菌浓度效果差异明显 , 高浓度的头孢