鸭源鸡杆ompW基因对菌体抗逆和致病性的影响机制及flfA基因突变菌株的构建

1、鸭源鸡杆 ompW基因对菌体抗逆和致病性的影响机制及flfA基因突变菌株的构建鸭源鸡杆菌 (Gallibacterium anatis,G.amatis)是一种革兰氏阴性菌 , 为巴氏杆菌科鸡杆菌属的代表种。 鸭源鸡杆菌感染蛋鸡后往往造成以腹膜炎和输卵管炎为主的病理变化 , 导致蛋鸡产蛋量下降、死亡率升高。该菌的多重耐药性使得抗生素治疗鸭源鸡杆菌病的效果不甚理想。用目前部分已知致病因子作为抗原的传统疫苗均无法提供理想的保护效果。新型疫苗的研制是当前鸭源鸡杆菌病防控研究的重点, 而鸭源鸡杆菌致病因子及致病机理的研究和鉴定是迫切需要解决的关键问题。外膜蛋白W(Outermembraneprotei

2、nW,OmpW)在革兰氏阴性菌生物被膜形成、黏附、耐应激中发挥重要作用 ; 菌毛通常在细菌黏附宿细中发挥关键作用。但这两个因子在鸭源鸡杆菌的具体作用还未被阐明。为了解OmpW及菌毛在鸭源鸡杆菌各种生物学功能中的作用, 进一步阐明该菌的致病机理, 本研究进行了以下几个方面的研究。主要研究结果报告如下 :1. 鸭源鸡杆菌 ompW缺失菌株ompW的构建及生物学特性研究鉴于外膜蛋白在革兰氏阴性细菌的黏附、抗应激、耐药等各种生物学功能中发挥重要作用 , 本研究利用 M-IV 培养基制备鸭源鸡杆菌感受态细胞, 用自然转化法将上下游同源臂和氯霉素抗性基因组构成的线性打靶序列转化鸭源鸡杆菌感受态细胞 ,PC

3、R和 Western Blotting鉴定表明成功构建了owpW缺失菌株AompW。然后比较了鸭源鸡杆菌RZ和 AompW的生长性能及溶血活性 , 发现 ompW缺失对鸭源鸡杆菌的生长速度、菌落形态大小及溶血活性没有影响, 表明 OmpW不参与鸭源鸡杆菌的这些生物学特性。最后应用微量稀释法测定了12 种抗菌药物对鸭源鸡杆菌RZ和 AompW的 MIC,结果显示相比鸭源鸡杆菌亲本菌株,AompW对土霉素和四环素的敏感性显著提高(p<0.01),二者的 MIC值分别降低了 8(128/16)和 32(128/4) 倍, 表明 OmpW在鸭源鸡杆菌抗四环素类药物中发挥重要作用。2.RZ 和 A

4、ompW的抗应激研究在构建 AompW的基础上 , 分析了鸭源鸡杆菌RZ和 AompW在不同 NaCl 浓度培养基中的生长情况 , 并用 SDS-PAGE和 Western Blotting分析鸭源鸡杆菌外膜蛋白的表达水平 , 最后用 RT-qPCR分析了不同盐度下鸭源鸡杆菌OmpW mRNA的转录水平的差异。结果显示在高盐培养基 (3%NaCl)中两者的对数期推迟 , 生长均受到影响 , 但RZ的生长速度高于 AompW的生长速度 ; 随着培养时间时间增加 ,AompW的生长受到的影响更大。 表明 RZ比 AompW更耐受高渗透环境 ,AompW的生长受高渗透环境影响更大。与正常 BHI 培

5、养时相比 ,RZ 在高 NaCl 含量 BHI 培养时 OmpW的表达被上调 ,与此对应的是鸭源鸡杆菌也上调了OmpW mRNA的转录水平 , 提示 OmpW可能在鸭源鸡杆菌抵抗渗透应激中发挥一定作用。在热应激、渗透压力及氧化应激环境下 ,AompW均低于 RZ对应激的抵抗率 , 表明 OmpW与抗应激能力有一定的相关性。3.RZ 和 AompW抗血清杀菌机制研究本研究分析了RZ 和 AompW在血清含量不同的培养基中的生存率 , 随后用 Western Blotting和 RT-qPCR分别分析了两者在不同血清浓度下的OmpW表达水平及其 mRNA转录水平。结果表明 RZ和ompW在低浓度血

6、清中的生存率差别不显著(p>0.05),随着血清含量增加 ,ompW的生存能力逐渐低于RZ的生存能力 ; 该结果提示 OmpW可能在鸭源鸡杆菌抗血清杀菌活性中发挥重要作用。为进一步阐明鸭源鸡杆菌OmpW在抵抗补体杀菌活性中的作用, 笔者将 RZ与鸡正常血清或热灭活血清一起孵育, 用 Western Blotting方法分析了 OmpW的变化。与对照组相比 ( 灭活血清处理 ), 细菌用鸡正常血清处理后其OmpW的表达及其mRNA的转录升高 ; 上述结果表明OmpW与该菌抵抗补体介导的杀菌活性有关。为初步探索鸭源鸡杆菌抵抗补体杀菌的通路, 将 RZ和 AompW分别与鸡血清+EDTA(抑制

7、所有补体通路 ) 或血清 +EGTA-Mg2+(仅允许补体旁路通路激活) 。结果显示 EDTA存在时 , 两株细菌的生存率几乎没有差异, 而且与对照组细菌的生存率相似 ; 血清中加入 EGTA-Mg2+时 , 两株细菌的生存率均降低, 说明补体旁路通路介导了补体杀菌活性 ; 血清中加入 EGTA-Mg2+时 ,ompW的生存率明显低于RZ的生存率 (p<0.05)。这些结果提示 OmpW通过抑制旁路通路发挥抗补体杀菌活性。4.RZ 和ompW致病性的研究分析了RZ 和ompW对小鼠的半数致死量 (Median lethaldose,LDso) 及小鼠感染后的生存能力。结果显示 RZ和 A

8、ompW对小鼠 LD50分别为 2.93 108CFU和 4.08 108CFU;相对于 RZ,ompW缺失使ompW对小鼠的 LD50提高 ;ompW感染组小鼠的生存率高于 RZ感染组小鼠的生存率 , 两组小鼠在临床症状上没有眼观差异; 小鼠的病理变化主要包括肠道肠壁变薄且透明, 肠、肺脏、肝脏和脾脏出血 , 但两组小鼠的病理变化无肉眼可见差异。上述结果表明ompW缺失导致鸭源鸡杆菌对小鼠的致病力有降低 , 但差异很小。随后测定了 RZ 和 AompW生物被膜形成能力和对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附性能 , 结果显示二者形成生物被膜能力均较弱, 无显著差异 (p>0.05);两者黏附鸡原

9、代输卵管上皮细胞的数量随着孵育时间增加而增加,ompW的黏附数量低于 RZ的黏附数量 , 但差异不显著 (p>0.05)。上述结果表明 OmpW参与了鸭源鸡杆菌对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附, 对生物被膜形成影响很小。5. 鸭源鸡杆菌菌毛结构蛋白缺失菌株flfA的构建及生物学特性研究利用上述自然转化法 , 用上下游同源臂和氯霉素抗性基因构成的线性打靶片段转化鸭源鸡杆菌感受态细胞 ,PCR和 Western Blotting鉴定阳性转化子 , 结果显示突变菌株不表达菌毛结构蛋白, 成功构建了菌毛结构蛋白缺失菌株flfA;随后分析了鸭源鸡杆菌RZ和flfA的生长性能和鸡原代输卵管上皮细胞黏附性能。结果显示FlfA的缺失没有影响鸭源鸡杆菌的生长性能和菌落形态;RZ 和flfA对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附数量随孵育时间的增加而增多, 而 FlfA的缺失使flfA的黏附数量显著低于RZ的黏附数量(p<0.05)。表明 F17 样菌毛蛋白在鸭源鸡杆菌黏附鸡原代输卵管上皮细胞中发挥关键作用。综上所述 , 作者用自然转化法成功构建了鸭源鸡杆菌突变菌株ompW和flfA,不仅为 OmpW和 FlfA 功能研究奠定了良好的基础, 而且为该菌其它基因的研究将提供了可靠的技术平台。OmpW在鸭源鸡杆菌抗四环素类药物中发挥重