鸡传染性支气管炎病毒Sczy3S1蛋白中和性单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

1、鸡传染性支气管炎病毒Sczy3 S1 蛋白中和性单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定鸡传染性支气管炎(Infectiousbronchitism,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒 (Infectious bronchitis virus, IBV)引起鸡的一种高度传染性呼吸道疾病 ,IB 可以感染所有日龄的鸡 , 能在多种组织细胞中复制 , 引发呼吸道疾病、 腹泻和产蛋量下降等 , 给造成养禽生产带来巨大的经济损失。 在这项研究中 , 通过制备针对 QX型 IBV 毒株 -Sczy3S1 蛋白的单克隆抗体 , 并用该单克隆抗体对 Sczy3 S1蛋白的抗原表位进行定位研究, 进一步认识 S1 蛋白

2、的分子结构和抗原表位结构,为研究表位疫苗和基于表位的诊断试剂提供科学依据。本研究首先对 Sczy3 S1 蛋白进行生物信息学分析, 结果表明 S1 蛋白结构的二级结构以 p- 折叠和转角为主 , 并有少量无规则区域；含有较多的两亲性- 螺旋和 p- 折叠区域 , 柔性区域和表面可及性区域, 有较好的免疫原性。选择抗原性较强的区域 81aa-422aa, 建立了 Sczy3 S1 原核表达载体 , 进行原核表达。扩增其核苷酸序列并克隆至pET-32a(+) 载体中 , 将阳性重组质粒pET-32-S1转化感受态细胞E.coli BL21 (DE3),经 IPTG诱导后 ,SDS-PAGE检测重组

3、表达蛋白 His-S1, 成功表达出了大小约为 57.5kDa 的重组蛋白。表达蛋白 His-S1 经 IPTG诱导浓度优化和诱导时间优化后, 大量表达 , 用 HisTrap FF crude 亲和层析纯化 ,纯化效果达到 90%以上。用 BAB L/c 鼠抗 Sczy3 高免血清与重组蛋白His-S1 做 Western blot分析 ,结果表明重组蛋白与鼠抗Sczy3 高免血清有较好的反应性, 可用于针对 S1蛋白单克隆抗体的筛选。利用差速离心法纯化IBV Sczy3 全病毒作为免疫原 , 免疫BALB/c小鼠 , 并用 BALB/c鼠高免血清和 BALB/c鼠阴性血清建立 ELISA检

4、测方法。Sczy3病毒免疫 BALB/c鼠 4 次后 , 取脾脏与 SP2/0 骨髓瘤细胞进行细胞融合,融合的诱导剂为PEG1500,共进行 3 次融合。融合细胞首先用Sczy3 纯化病毒为包被抗原 ELISA 检测 , 筛选出 Sczy3 日性单克隆抗体； Sczy3 阳性单克隆抗体用重组蛋白 His-S1 作为包被抗原第二轮His-S1-ELISA 检测 , 筛选出针对 Sczy3 S1蛋白的阳性单克隆抗体。阳性单抗用 Sczy3 和重组蛋白 His-S1 经过 Western blot方法检测 , 最终获得了两株能够稳定分泌IBV SI 蛋白单克隆抗体 (mAb)的杂交瘤细胞株 1D5和

5、 6A12。用鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒检测两株单克隆抗体均为IgM 亚型。与 AIV(H5、 H9亚型 ) 、NDV ELISA反应 ,mAbs1D5和 6A12 特异性良好。与其他 10 株 IBV 毒株 ELISA 反应 ,mAbs 1D5 和 6A12具有交叉反应性 ,mAb 1D5 与CK/CH/SCYA/10I和 CK/CH/SCMY/10I的反应性低 , 比 6A12交叉反应性差。Sczy3 的第 8 代尿囊液病毒接种CEK细胞 , 建立 Sczy3 CEK细胞适应株Sczy3-C。 Sczy3-C 第 20 代测定 TCID50,结果为 10-5.64/0.2 mL。终点法中和

6、试验测定mAbs 1D5和 6A12 的中和性 ,mAbs 1D5 和 6A12都具有中和性 ,mAb 1D5 的中和效价为 1：40.6,mAb 6A12 的中和效价为 1：44.7 。制备出的 mAbs 1D5和 6A12 是针对 Sczy3 S1 蛋白的中和性单克隆抗体。为了鉴定制备的 mAbs 1D5和 6A12 在 IBV Sczy3 SI蛋白上所对应的表位 ,将 mAb1D5和 6A12作为靶分子包被 ELISA板 , 用噬菌体展示随机 12 肽库进行生物淘选。经过 3 轮淘选 , 每轮增加 Tween-20 浓度和降低靶分子包被浓度来增加筛选强度。两株单抗均随机挑选10 个噬菌体

7、克隆进行扩增和ELISA 鉴定 , 阳性噬菌体PCR扩增获得核心序列并测序。mAbs 1D5和 6A12 均获得 3 条序列 , 与 Sczy3 S1蛋白比对序列发现mAb1D5的共有序列与 S1 蛋白 87-PPQGMAW-93一致 ,mAb 6A12的共有序列与 S1 蛋白 412-IQTRTEP-418一致。同源性分析发现 ,87-PPQGMAW-93在分属 8 个基因型 32 株 IBV 中变异性较大 ,特别是与 CK/CH/LSC/99I-Type 、Proventriculus-Type和 TW-Type的差异性较大；而 412-IQTRTEP-418在 8 个基因型中较保守 , 与 JP-Type 的差异较大。原核表达含有抗原表位的 S1 蛋白短肽 pET-se1 (77aa-107aa) 和 pET-se2 (399aa-424aa),利用 mAbs1D5和 6A12分别对表达产物进行Western blot分析 , 结果显示 , 表达的融合蛋白 pET-se 1 可被 mAb 1D5特异性识别 ,pET-se2 可被 mAb 6A12特异性识别 , 由此表明 87-PPQGMAW-93和 412-IQTRTEP-418为 IBV Sczy3 S1 蛋白的两个线性中和性 B 细