第34章 DNA的复制-2.ppt

1、第34章 DNA的复制,本章主要内容,一、DNA的复制 DNA聚合酶 复制的过程 复制的特征 二、聚合酶链式反应 （PCR） 三、DNA的修复,DNA聚合反应的特点：,需要模板指导 以四种dNTP为底物 需要有引物，3-羟基存在 DNA链的生长方向是5 3 产物DNA的序列与模板互补,DNA聚合酶（DNA polymerase ）,温故:,体内,终止阶段（Termination ）,延伸阶段（ Elongation）,起始阶段（Initiation）,DNA复制的过程,温故:,体内,DNA复制的特征,半保留复制 （semiconservative replication）,半不连续复制 （se

2、midiscontinuous replication）,温故:,体内,背景介绍： 获得大量的DNA 化学合成 基因重组,体外,1983年，美国Cetus公司的Kary Mullis,发明了聚合酶链式反应（PCR）。,二、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR), （一） 定义 （二） 发明 （三） 基本原理 （四） 特点 （五） 发展和应用,知新：,体外,（一）PCR的定义,聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR)： 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法， 故又称为基因的体外扩增法。,体外,（二） PCR的

3、发明,故事发生在1983年4月,72,94,55,PCR循环,在试管中模拟细胞内DNA的复制,DNA聚合酶,美国黄石国家公园的温泉,嗜热水生菌,Taq DNA聚合酶,耐高温DNA聚合酶,The Nobel Prize in Chemistry 1993,for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry,Kary B. Mullis (1944-) La Jolla, CA, USA,Michael Smith (1932-) University of British Columbia Van

4、couver, Canada,（三）PCR的基本原理,首先使DNA变性,两条链解开, 然后使引物与模板退火,二者碱基配对; DNA聚合酶随即以4种dNTP为底物,在引物的引导下合成与摸板互补的新链。 重复这个过程， DNA以指数方式扩增。,体外,三个阶段,高温（9095） 变性(Denaturation),循环（n次）,低温（4060） 退火(复性) (Annealing),适温（7075） 延伸 (Elongation),动画,n次循环后DNA序列扩增的数量,No. of No. Amplicon Cycles Copies of DNA 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64

5、 20 1,048,576 25 33,554,432 30 1,073,741,824,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,8 cycle = 256 Amplicon,扩增的公式：Y=( 1+X ) n 其中：Y产量；X扩增效率； n循环次数； 设X=60%， n=30， Y =1.33106,（四）PCR的特点,特异性强 灵

6、敏度高 简便、快速 对标本的纯度要求低,发展： PCR仪的变迁、PCR的种类 应用： 生物学、医学,（五）PCR的发展和应用,PCR仪,PCR仪的变迁,不对称PCR（Asymmertric PCR） 嵌套式PCR（Nested PCR） 原位PCR（In situ PCR） 逆转录PCR（Reverse transcription PCR，RT-PCR） 实时荧光定量PCR (Real time fluorescent quantitative PCR，FQ PCR) 反向PCR（Inverse PCR） 重组PCR（Recombinant PCR） 多重等位基因PCR（Multiplex a

7、llele PCR） Anchored PCR; Long fragment PCR; DDRT-PCR; LM-PCR; RACE; Flow chip PCR; Immuno PCR; LP-PCR; NASBA; RFLP-PCR; AFLP-PCR; RAPD-PCR; SSCP; TAS,PCR的种类,.,PCR的应用,生物学 基因克隆、人工基因构建、DNA序列测定、 基因定点突变、基因型（突变）检测、 SNP分析、遗传背景分析、生物物种鉴定、系统进化研究、 基因表达量研究（Real-time PCR） 、 基因表达谱研究（ DNA chip, SAGE） 医学 临床医学：遗传病诊断、疾病基因检测（肿瘤诊断）、 病原体检测 法医学： 个体识别、性别鉴定、亲子鉴定,限制性片段长度多态性PCR法：,限制性内切酶,恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）检测,Ras基因,突变,正常人,患者,Example,电泳,甲型H1N1流感病毒 原理：实时荧光定量逆转录PCR技术 逆转录：RNA cDN