榨菜和紫甘蓝嫁接嵌合体后代表观遗传变异的发生及其维持机理

1、榨菜和紫甘蓝嫁接嵌合体后代表观遗传变异的发生及其维持机理本研究以榨菜 (Brassica juncea(L.)Czern.et Coss.var.tumitda Tsen etLee) 与紫甘蓝 (B.oleracea L.var.capitata L.)的茎尖嫁接嵌合体为材料, 通过对组织培养条件下嵌合体茎段基部不定芽的诱导获得嵌合体的无性繁殖后代, 利用该无性后代开展了嫁接诱导性状变异及其维持机制的分子机理研究。通过形态学观察以及分子标记鉴定, 明确无性后代的细胞谱系; 通过全基因组甲基化图谱分析 , 明确亲本和后代的 DNA甲基化模式差异 , 分析 DNA甲基化变异位点与变异性状的关系

2、; 通过 small RNA高通量测序 , 解析嫁接引起的小RNA种类和表达量的变化 , 并通过对小干扰 RNA(siRNA)和 DNA甲基化的关联分析 , 明确全基因组甲基化差异位点与 siRNA 的关系 , 阐明 siRNA 调控甲基化变异的机理。通过对 siRNA 表达模式及甲基化酶转录水平的分析 , 探究嫁接诱导表观遗传变异的维持机制。主要结果如下 :(1) 以榨菜和紫甘蓝种间周缘嵌合体 TCC茎尖分生组织 (shoot apical meristem,SAM) 三个细胞层 , 由外而内为 L-L -L , T代表 LI 起源于榨菜 tubermustard, C代表 L和 L起源于紫

3、甘蓝redcabbage 的茎段为外植体进行不定芽的诱导, 并利用形态学特征和分子标记鉴定不定芽的细胞谱系。在添加不同浓度 6-BA 的 MS诱导培养基中 , 从茎段基部直接再生的不定芽诱导频率随 6-BA 浓度的升高而增大。特异引物PCR以及简单重复序列标记显示不定芽起源于紫甘蓝谱系 , 即嵌合体 SAM的 L和 / 或 L细胞层 , 命名为r-CCC(r=regenerated)。对 r-CCC 通过腋芽诱导进行无性繁殖, 构建无性后代 r-CCCn(n =generation)。再生的不定芽及其无性后代叶片光滑无表皮毛, 叶脉处和茎为紫红色 , 在形态学上与紫甘蓝亲本相似 , 然而与对照

4、材料相比表现出叶片蜡质含量明显减少的表型变异。扩增片段长度多态性分析结果显示 ,r-CCC 中未出现榨菜亲本的特异条带 ,但与 r-s-CCC(s=self-grafted) 相比存在 0.76%的差异条带 , 且差异位点主要分布于非编码的基因间区。 (2) 对 r-CCC4 和 r-s-CCC4 全基因组甲基化图谱分析发现 ,r-CCC4 中 CHH类型胞嘧啶的甲基化水平和比例均高于 r-s-CCC4, 并且在转座元件等重复序列上的 CHH类型甲基化水平升高最为明显。对甲基化差异位点相关基因(DMG)的 KEGG通路富集分析发现 ,13 个 DMGs参与蜡质合成 Cutin,suberine

5、and wax biosynthesis通路。通过重亚硫酸氢盐测序技术对基因 LOC106335792,LOC106298662,LOC106311786和LOC106333935上差异位点的甲基化模式的验证结果与全基因组重亚硫酸氢盐甲基化测序数据一致。实时荧光定量 PCR分析结果表明 , 差异基因在 r-CCC4 和 r-s-CCC4 中的转录水平不同 , 其中基因 LOC106335792和 LOC106311786在 r-CCC4中的表达水平显著降低 , 可能为蜡质含量变异的候选基因。 (3) 对 r-CCCn 和 r-s-CCCn 中蜡质合成相关 DMGs的甲基化模式分析发现 , 嫁接

6、引起的甲基化模式变异能够在无性繁殖过程中稳定维持。对相关甲基化转移酶的转录水平分析结果表明,MET1在 r-CCC2和 r-CCC4 的表达水平显著升高 , 推测其负责维持 CG类型的 DNA甲基化变异 ; 而 CMT3在 r-CCCn中的表达水平均低于r-s-CCCn, 可能参与维持CHG类型的甲基化变异。此外, 对嵌合体花粉中的甲基化模式分析发现,DNA甲基化变异可以通过减数分裂进行传递。(4) 以 r-s-TTT,r-s-CCC 和 r-CCCn 为材料 , 通过 small RNA 高通量测序分析异源嫁接对小 RNA种类及表达量的影响。研究结果揭示 , 嵌合体无性后代中绝大多数 siR

7、NA 的表达水平明显升高 , 并且与基因组重复序列相关小 RNA的比例在无性后代中呈现逐渐升高的趋势。在多代无性材料中鉴定到 1135种嫁接诱导的特异 siRNA, 包括 159 种榨菜亲本中的特异转录产物。此外 , 对 miRNA的表达水平分析发现 ,22 种 novel miRNA的表达水平在 r-s-CCC 和 r-CCCn 中表现出显著差异 , 差异表达的 novelmiRNA 靶基因主要编码功能蛋白 , 包括锌指蛋白、 ABC运载体以及与抗病性有关的TAO1蛋白等。此外 , 一种与光周期开花途径相关的已知miRNAbol-miR157a在 r-CCCn 中被显著抑制表达。(5) 通过 DNA甲基化和 small RNA关联分析 , 发现 65%的特异 siRNA与重复元件相关 , 而且重复元件相关siRNA 靶定