病原物的分离与培养

1、病原物的分离与培养病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。病原物的分离与培养，需经以以几个步骤:1.有关器皿的灭菌和消毒；2.制作培养基；3.病原菌的分离4.病原菌的培养。、灭菌与消毒灭菌与消毒是两个不同的概念。灭菌则

2、是指杀死一切微生物的营养体和孢子。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。(一) 热力灭菌热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。1干热灭菌 干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160170)，时间长12 h。但干热灭

3、菌温度不能超过180 ，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。干热灭菌使用的仪器是烘箱。干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160170)进行灭菌。此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到70以前，切勿

4、自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。2 湿热灭菌(1) 高压蒸汽灭菌 此法是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内，0.1MPa，121保持1530 min进行灭菌。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌。这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等，也可用于玻璃器皿的灭菌。(2) 常压蒸汽灭菌 在不具备高压蒸汽灭菌的情况下：常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌法。对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸汽灭菌。这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行，也可用普通蒸笼进行灭菌。由于常压，其温度不超过100，仅能使大多数微生物被杀死，而芽孢

5、细菌却不能在短时间内杀死，因此可采用间歇灭菌以杀死芽孢细菌，达到彻底灭菌的目的。常压间歇灭菌是将灭菌培养基放人灭菌器内，每天加热100，30 min，连续3 d，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物取出放室温下1824 h，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热100，30 min，发育的营养体又被杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。(二) 过滤除菌许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热消毒灭菌方法，均会被热破坏，因此采用过滤除菌的方法。应用最广泛的过滤器有：(1) 蔡氏过滤器 该过滤器是由石棉制成的圆形滤板和一个特制的金属（银或铝）漏斗组成，分上、下两节。过滤时，用螺旋

6、把石棉板紧紧夹在上、下两节滤器之间，然后将溶液置于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张新滤板。根据其孔径大小，滤板分为3种型号：K型最大，作一般澄清用；EK滤孔较小，用来除去一般细菌；EK-S滤孔最小，可阻止大病毒通过。使用时可根据需要选用。(2) 微孔滤膜过滤器 这是一种新型滤器，其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤维酯的混合物制成的薄膜。微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盖盒组成。出口处可连接针头，入口处可连接针筒。使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤

7、器。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分。但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为0.22m，但若要将病毒除掉，则需更小孔径的微孔滤膜。微孔滤膜过滤除菌的主要操作步骤为： 组装、灭菌 将0.22m孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧。压平，包装灭菌后待用(0.1MPa、121.5灭菌：20 min)。连接。将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作方式连接于装有待滤溶液注射器上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。 压滤 将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤压过滤到无菌试管中。滤毕，将针头拨出。压滤时，用力要适当，

8、不可太猛太快，以免细菌被挤压通过滤膜。提示: 整个过程应在无菌条件下严格无菌操作以防污染，过滤时应避免各连接处出现渗透现象。(三) 辐射灭菌 紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200300 nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260 nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA的交联，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成O，再使O2氧化生成臭氧(O3)，或使水氧化生成过氧化氢(H2O2)。O3和H2O2有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以只适用于无菌室、接种箱的空气及物体表面的

9、灭菌。注意事项: 紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。紫外线灯距照射物以不超过1.2 m为宜。此外，采用60Co-射线灭菌，也已广泛用于不能进行加热灭菌的纸、塑料薄膜，各种积层材料制作的容器以及医用生物敷料皮等的灭菌。射线灭菌的最大优点是穿透力强，可在厚包装完好条件下灭菌。(四) 化学药品灭菌化学药品消毒灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂，如重金属离子等；只是阻抑细菌代谢机能，使细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂，如磺胺类及大多数抗生素等。化学药品对微生物的作用

10、是抑菌还是杀菌以及作用效果还与化学药品浓度的高低、处理微生物的时间长短、微生物的种类以及微生物所处的环境等有关。植物病理学实验室中常用的化学药品有2煤酚皂溶液(来苏尔)、0.25新洁尔灭、0.1升汞、35酌甲醛溶液、75乙醇溶液等。消毒与灭菌不仅是从事植物病理学和整个生命科学研究必不可少的重要环节和实用技术，而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面均具有重要的应用价值。根据不同的使用要求和条件选用合适的消毒灭菌的方法。附: 高压灭菌1、目的要求学习灭菌与消毒的基本原理及应用范围，学习高压蒸汽灭菌的操作方法。2、基本原理高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使

11、灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中排尽后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，锅内冷空气的排除是否完全极为重要。因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用0.06 MPa、112灭菌15 min，但为了保证效果，可将其他成分先行121灭菌20 min，然后以无菌操作手续加入

12、灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以0.1MPa，121灭菌20 min；即可，而盛于大瓶内的培养基最好以0.1MPa、122灭菌30 min。实验中常用的非自控高压蒸汽灭菌锅有卧式和手提式两种。其结构和工作原理相同，本实验以手提式高压蒸汽灭菌锅为例，介绍其使用方法。全自动高压蒸汽灭菌锅在设定好有关的参数后，加温、放气、灭菌、干燥可一次完成，使用方法可参照厂家说明书。3、材料、试剂与仪器材料 马铃薯葡萄糖培养基 (PDA)。仪器与用具 培养皿、手提式高压蒸汽灭菌锅、可调式电炉等。4、操作步骤(1) 首先将内层锅取出，向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。提示：切勿忘记加水，同时加

13、水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。(2) 放回内层锅，并装入待灭菌物品。提示：注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。(3) 加盖 并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。(4) 用电炉加热 并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，调节电炉控温旋钮，维持压力至所需时间。本实验用0.1Mpa l21.5，20 min灭菌。提示：灭菌的主要因

14、素是温度而不是压力。因此，锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。(5) 灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”后，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。提示: 压力一定要降到“0”后，才能打开排气阀开盖取物。否则会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。(6) 将取出的灭菌培养基放入25温箱培养48 h，经检查若无杂菌生长，即可待用。二、培养基的制作1、目的要求了解培养基的配制原理，掌握培养基的制备方法。2、基本原理在植物病理学研究工作中经常要使用各种不同的培养基。

15、培养基是按照生物生长繁殖所需要的各种营养，用人工方法配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、维生素以及水分等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适pH范围内才能生长得更好，因此，对不同种类的微生物应将培养基调节到一定的pH范围。般而言，真菌调节到微酸，细菌调节到微碱。培养基的种类很多，不同的微生物所需要的培养基不同。依物理性状可分为液体的、固体的和半固体的三种。固体培养基是在液体培养基中加入1.5 %2 %的琼脂，半固体培养基是加入0.2 %0.5 %的琼脂。琼脂(agar) 起凝固作用，一般微生物均不能分解利用。根据营养物质来源的不同，培养基可分为天然、半合成和合成培养基三类。天然培

16、养基是以自然界原有的有机物为材料经灭菌后制成，如马铃薯、胡萝卜、水果、大麦粒、高粱粒等。半合成培养基中既有一些天然的有机物质，又有一些成分简单或明确的化合物。如常用的马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、肉汁胨培养基(NA)等。合成培养基是由一些成分明确的化合物配制而成的，无任何成分不明确的物质，常用于研究微生物的生理生化性状，如查氏(Czapek)培养基等。根据培养基用途不同，可分为生长繁殖培养基、富集培养基、贮存培养基、选择性培养基和鉴别培养基等。在植物病理学研究中，最常用培养基有马铃薯葡萄糖培养基，主要用于分离培养病原真菌。在培养基配制完之后，必须经过灭菌，以便彻底杀死其中原有的一切微生物。3、

17、材料、试剂与仪器材料 马铃薯。试剂 葡萄糖、琼脂等。仪器与用品 高压蒸汽灭菌锅、pH试纸(或酸度计)、试管、铝锅、搅拌棒、三角瓶、烧杯、漏斗、量筒、纱布、棉花、天平等。4、操作步骤PDA培养基(马铃薯葡萄糖培养基) 马铃薯（去皮）200 g 、葡萄糖20 g、琼脂1520g、蒸馏水1000 ml ，自然pH。在PDA培养基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖，这样配制的培养基也称为PSA培养基。(1) 称量 称量去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂1520 g。提示：琼脂加入的量取决于琼脂的质量，质量好的15 g就够了，质量差的应适当增加。另外，在夏天气温较高时，适当增加用量。(2) 将马铃薯切成

18、小块，放入锅中，加水1000 ml，煮沸30 min。用纱布滤去马铃薯残渣。(3) 将马铃薯滤液放回锅中，加入琼脂，加热熔化。提示：在琼脂熔化的过程中，需要用玻璃棒不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。(4) 加入葡萄糖 葡萄糖溶解后，加入适量的水以补充加热过程中损失的水分，定容至1000 ml。提示：通常在制作培养基的锅内用红蓝铅笔标记出不同体积的刻度，如1 000 ml、2000 ml等，在定容时直接将水加至已标记的刻度即可。(5) 分装 根据不同的实验目的，可将配制的培养基分装于试管内或三角瓶内。分装试管，其量为管高的15，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积之一半为

19、宜。(6) 加塞 在管口或瓶口塞上棉塞。棉塞要用未脱脂的经弹松的棉花，棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发，故在植物病理学研究工作中普遍使用。正确的棉塞是形状、划、松紧与管口或瓶口完全适合，过紧时妨碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的，且棉塞过小往往容易掉进试管内。正确的棉塞头较大，约有13在外，23在试管内。分装过程中注意不要使培养基沾染在管(瓶)口上以免浸湿棉塞，引起污染。(7) 包扎 加塞后，将试管用线绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳扎好。用记号笔注明培养基名称、配制日期、组别、制作人等。(8) 灭菌 将上述培养基以0.

20、1MPa，121，高压蒸气灭菌20 min。(9) 搁置斜面 将灭菌的试管培养基竖置冷至50左右(以防斜面上冷凝水太多)，将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。培养基经灭菌后，必须放在37温箱培养24h，无菌生长者方可使用。PDA培养基一般不需要调pH。对于要调节pH的培养基，一般用pH试纸测定其pH。如果培养基偏酸或偏碱时，可用l molL NaOH或l molL HCl溶液进行调节。调节时应逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。5、流程图培养基配制 高压灭菌 培养 观察三、病原菌的分离培养和纯化1、目的要求(1) 了解

21、分离与纯化微生物的基本原理及方法。(2) 掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。(3) 掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。2、基本方法植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。3、材料、仪器与用具3.1 材料 (1) 稻瘟病（叶、病节、病穗颈）(Pyricularia

22、oryzae)。(2) 柑桔炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）。(3) 黄瓜灰霉病（Botrytis cineria）。(4) 番茄灰霉病（果）(Botrytis cinerea)。(5) 黄瓜菌核病（果）(Sclerotinia sclerotiorum)。(6) 黄瓜细菌性角斑病（叶）(Pseudomonas syringae pv1achryrnans) 。(7) 水稻白叶枯病（叶）(Xanthomonas campestris pvoryzae) 。(8) 白菜软腐病（叶）(Erwinia carotovora subsppcarotovora)。3

23、.2培养基 PDA培养基；肉膏蛋白脉培养基；加寄主组织煎汁的培养基等。3.3仪器与用品 超净工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70酒精、0.1升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、不锈钢锅等。4、实验操作(一) 病原真菌的分离1组织分离法 其步骤为：(1) 取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。提示：无菌操作应注意下面几点：工作前将所需的物品都放在超净工作台内；操作前用肥皂洗手，操作时还需用70 酒精擦拭双手；无菌操作时，呼吸要轻，不要说话。（2） 用无菌操作法向培养皿中加

24、入25乳酸12滴(可减少细菌污染)，然后将融化而冷至60左右的PDA培养基倒人培养皿中，每皿倒1015 ml，轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培养基。提示：加入25乳酸12滴，可减少平板上出现污染细菌菌落。除乳酸外，在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长，也是常用的方法。加青霉素(20gm1)可以抑制G+ 细菌生长；加多黏霉素B(5.0gml。)可以抑制G-细菌生长；加链霉素(40gml)或氯霉素(50gm1)可以抑制大部分细菌的生长。除了氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45左右(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)时加入。倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领，

25、不必在火焰上方，一般很少污染。(3) 取真菌叶斑病的新鲜病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处，)切取小块(每边长34 mm)病组织数块。提示：选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健组织的部分分离。（4）将病组织放入70酒精中浸35s后，按无菌操作法将病组织移入0.1升汞液中分别表面消毒05、1、2、3、5 min (也可使用其他表面消毒剂)，如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些。然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。提示：先用70的酒

26、精浸23 s是为了消除寄主表面的气泡，减少表面张力，70的酒精亦用于表面消毒，处理的时间较短(一般数秒至l min)升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自30s至30min不等，一般情况下，需时间35 min。(5) 用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放46块。提示：在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染。(6) 将培养皿倒置放入25左右恒温箱内培养。一般34 d后观察待分离菌生长结果。(7) 若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌。在无菌条件下，用接种针(铲)自菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上，在25 左

27、右恒温箱内培养，数日后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长即得该分离病菌纯菌种，便可置于冰箱中保存。提示：除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外，还要在显微镜下检查，进一步确定。如果是对未知病原菌的组织分离，则要将长出的菌落分别转出，通过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌。在组织分离工作中，如果植物材料体积较大且较软(如患灰霉病的番茄果实)，在分离过程中可直接挖取内部患病组织移入平板培养基上，完成分离工作。2. 稀释分离法(1) 取灭菌培养皿三个，平放在湿纱布上，编号，并注明日期、分离材料及分离人姓名。(2) 用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一皿中分别注入0.51.0 ml。(3) 用移植环

28、蘸一滴孢子悬浮液，与第一个培养皿中的灭菌水混合，再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中，混合后再移三环到第三个培养皿中。(4) 将熔化并冷却到4550的培养基，分别倒在三个培养皿中(为防止细菌污染，也可以向每个培养皿中事先加入12滴25乳酸)，摇匀，凝固，要使培养基与稀释的菌液充分混匀。提示： 倒平板时的培养基温度一定要掌握好，过热易将病原菌烫死而使分离失败，过冷则倒入培养皿中后难以形成平板，不利于分离。(5) 将培养皿翻转后置恒温箱(25)中培养，数日后观察菌落生长情况。(6) 挑菌 将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取，接种到斜面培养基上，置25左右培养。待菌长出后，检查菌是否单纯，

29、若有其他菌混杂，就要再一次进行分离纯化，直到获得纯培养。(二)病原细菌的分离病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用。在进行分离之前，首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断，即经过镜检确认有喷菌现象以后，才对该病组织作分离工作。稀释分离法是最经典的标准分离法，方法同上述真菌分离。除去上述稀释分离法以外，较为方便的是划线分离法：(1) 预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒入培养皿中，凝成平板后，翻转放在30恒温箱中24 h，使表面无水滴凝结。也可凝成平板后直接使用。(2) 将病组织先用0.1升汞表面消毒0.52 min，再用无菌水换洗3次后，放在灭菌培养皿中的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎，并让组织碎块