分子生物学理论讲授-重组人白介素-18基因工程菌的构建

1、分子生物学实验-理论讲授,重组人白介素-18基因工程菌的构建,概要,一、分子生物学的基本含义,在分子水平上研究生命现象的科学。以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，从分子水平阐明生命现象和生物学规律，并在分子水平上改造和利用生物的一门学科。,分子生物学研究三大领域,数、理、化相关学科,生物学实验技术,渗透 交叉,近代生物学,个性,共性,宏观生物学 （生态学为核心）,微观生物学 （分子生物学为核心）,细胞水平,分子水平,结构生物学，发育生物学，神经生物学等新兴学科发展,生物多样性 研究,资源保护与 利用,人类生态环境的保护 工农业生产持续发展,分子生物学

2、在现代生物学中的地位,分子生物学渗透到生物学的几乎所有领域，生命科学领域的带头学科。,分子生物学发展简史,进化论（1859，Darwin）和遗传学说（1865，Mendel） 蛋白质是生命的主要基础物质 生物遗传的物质基础是DNA 现代:DNA双螺旋结构模型（1953，Watson；Crick） 基因工程技术,二、基因工程,基因工程,基因拼接技术，DNA重组和分子克隆技术。 外源基因（供体）在工具酶的协助下与载体进行体外重组，后导入受体细胞内，以改变生物原有的遗传特性、获得新物种、生产新产品。,1996年，英国科学家伊恩维尔穆特博士用成年羊的体细胞克隆出了一只小羊。 克隆技术发展中成功克隆的二

3、十余种动物。,全球约的大豆、的玉米、的油菜都是转基因产品。,基因工程试剂的高回报,白细胞介素-2 410元/ug 胰岛素 10.2元/mg 胰岛素依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，2000Kg胰腺提取100g。将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g！ 2014年全球生物药销售额近1500亿美元。肿瘤坏死因子抗体类以316亿美元，其次为癌症抗体、胰岛素及其类似物、炎症抗体。,农业部谈非转基因广告：“与食品安全无关联”。 中国工商部“禁止在广告中宣称非转基因产品更健康、更安全”。,基因工程的组成,上游技术：基因重组、克隆和表达的设计与构建； 下游技术：涉及到基因工程菌或细

4、胞或基因工程生物体的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。,主要内容和步骤,基因工程的基本条件,1.外源DNA,通过基因工程技术或病毒感染等途径引入靶细胞中的DNA序列,2.载体,质粒（细胞染色体外能够自主复制的小型双链环状DNA分子）最常用的载体。 其他载体：噬菌体、粘粒、病毒等,携带外源DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具,2.1载体的功能,2.2载体特征,1、具有针对受体细胞的亲缘性(可转移性)。 2、具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点，以供外源DNA插入。 3、有遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。 4、具有多种单一的核酸内切酶识别位点。 5、具有

5、较高的外源DNA装载能力。 6、对宿主细胞无害。,2.3多克隆位点,2.4遗传标记基因,1、 标记基因的作用 1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞。 2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。 2、标记基因的种类 1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子） 主要是抗生素抗性基因: Ampr ，Tetr ，Kanr，Strr 2）生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ,lacZ蛋白分为链和链。只有当两者都存在时才会表现出活性。 蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。野生型大肠杆菌产生的-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-

6、氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。使整个培养菌落颜色变化，是鉴定和筛选的最直观有效的方法。,2.5半乳糖苷酶(LacZ)基因和蓝白斑筛选,2.6蓝白斑筛选原理,pUC质粒,受体菌株,lacZ,许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列编码-互补肽，与宿主编码的缺陷型-半乳糖苷酶基因互补（ -互补）。 有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。,3.工具酶,限制性内切酶特异切割 核酸连接酶DNA和RNA的连接 核酸聚合酶DNA和RNA的合成 核酸酶DNA和RNA的非特异性切割 核酸末端修饰酶DNA和RNA的末端修饰 其它酶类-生物细胞的破壁，转化等,

7、3.1限制性内切酶,是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶,同位酶；同裂酶；同尾酶。,3.2DNA连接酶,连接DNA链3-OH末端和，另一DNA链的5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链,3.3DNA聚合酶,以DNA为复制模板，从将DNA由5端点开始复制到3端的酶。主要活性是催化DNA的合成,4.基因工程受体,在转化和转导（感染）中接受外源基因的宿主细胞,便于重组DNA分子导入受体细胞 便于重组DNA分子稳定存在于细胞中 便于重组子的筛选 遗传稳定性高，易于扩大培养与发酵 安全性高，无致病性 最好是内源蛋白水解酶缺失或含量低

8、密码子无明显偏爱性 具有较好的翻译后加工机制，便于真核基因的表达 理论与实践上具有较高的应用价值,4.1受体类型及特征,大肠杆菌：DH5、TB1、JM109、JM101 酵母菌： 毕赤酵母 啤酒酵母 哺乳动物细胞,基因工程实验需要掌握的技术,聚合酶链式反应（条件和步骤） 质粒提取 （试剂盒） 酶切、连接 （酶类型和反应条件） 感受态细胞制备（步骤） 转化（条件和步骤） 筛选鉴定（原理） 电泳（条件）,5主要步骤,5.1连接产物转化细胞,感受态细胞制备方法： 一、CaCl2处理后的细菌转化或转染：用CaCl2 处理并加以热激促进DNA进入菌体; 二、电激法：即施加短脉冲的电荷以促进DNA 吸收。

9、,转化是将外源DNA分子引入受体细胞使之获得新的遗传性状的一种手段,感受态细胞：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。,氯化钙法,是将处于对数生长期的细菌置于0的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca离子使细胞膜磷脂层形成液晶结构，然后经42热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加。,5.2重 组 子 的 筛 选,1.根据重组载体的特点进行筛选：抗药性筛选法、插入失活 2.营养缺陷型筛选法：载体上携带某些营养成分基因而受体菌缺失 3.限制性酶切分析 4.核酸杂交：原位杂交、Southern、Northern 5.PCR 表达产

10、物的检测：电泳、测活、蛋白印迹 序列测定,重组子, 含有重组DNA分子的转化细胞,5.3聚合酶链式反应,一种用于放大扩增特定的DNA片段的技术,5.4琼脂糖凝胶电泳,三、重组人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的构建,白细胞介素18,白细胞介素18是近年来新发现的细胞因子； 具有较强的免疫调节生物学活性； 与肿瘤的发生发展密切相关； 对多种肿瘤细胞显示出较强的抑瘤效应。,基因、载体、受体菌株,基因,载体,菌株,质粒,酶切连接,转化,质粒提取,PCR,实验技术要求,应掌握的实验技术 酶切,连接 凝胶回收 制备感受态细胞 质粒提取 PCR 琼脂糖凝胶电泳,考察指标 电泳、蓝白斑数量 电泳 感

11、受态细胞转化率 电泳 电泳 电泳,实验流程: 第一天 8AM-5PM,rhIL-18基因的PCR产物（ 0.5Kb ）,质粒pUC18 （2.7kb）,Bgl和Pst双酶切,BamH和Pst双酶切,浓度1%琼脂糖凝胶电泳,凝胶回收与溶液回收,电泳检验,T4连接酶连接过夜,配制 LB 液体与固体平板培养基,灭菌,37过夜培养 E .coli JM109菌株,连接反应中 目的基因：质粒=3：1 连接反应体系中加入目的基因和质粒酶切片断的体积比,=,实验流程: 第二天 8AM-5PM,CaCl2 法制备E.Coli JM109感受态细胞,实验组连接体系,42热激转化90s,37温柔孵育45min,涂

12、布平板,37过夜倒置培养,实验流程: 第三天 1PM-5PM,观察阴性对照组菌落生长情况,有无菌落,挑取1白色单菌落,37液体培养基过夜培养,观察实验组菌落生长情况,统计蓝斑，白斑菌落数量,观察空菌对照组菌落生长情况,统计菌落数量,观察空菌对照组菌落生长情况,统计菌落数量,第5组Ampc+,第4组Ampc-,实验组1 Ampc+ 100L转化后的大肠杆菌 实验组2 Ampc+ 400L转化后的大肠杆菌 阳性对照 Ampc+ 10L 转化pUC18的大肠杆菌 阴性对照1 Ampc+ 感受态细胞 阴性对照2 Ampc- 感受态细胞,实验流程: 第四天 8AM-5PM,提取质粒DNA,浓度1%琼脂糖凝胶电泳,PCR,浓度1%琼脂糖凝胶电泳,Sc