异基因外周血干细胞移植后T淋巴细胞和粒细胞嵌合体的检测及其临床意义的研究

1、山西医科大学硕士学位论文异基因外周血干细胞移植后t淋巴细胞和粒细胞嵌合体的检测及其临床意义的研究姓名：马建华申请学位级别：硕士专业：血液内科学指导教师：苏丽萍20070508山西医科大学硕士学位论文摘要目的：通过检测异基因造血干细胞移植(allogene haemopoietic stem cmlltran印lantation，allohsct)后患者外周全血、外周血t淋巴细胞和粒细胞的嵌合状态，探讨后两者的嵌合动力学及其与移植后复发、移植物抗宿主病(graft vcrsus host disease，gvid)、免疫抑制剂的调整等临床事件中的关系。方法：(1)选取我科2006年4月-2006

2、年lo月确诊为急、慢性白血病，给予allo-hsct治疗的患者6例，急性白血病患者均处于第一次完全缓解状态(the first complete remission，crl)，慢性白血病均为慢性髓性白血病第一次慢性期(the first chromc phase，cpl)，男4例，女2例，年龄24-63岁(中位年龄455岁)(2)预处理方案：其中l例采用非清髓allo-hsct，预处理方案为faac方案，其余5例采用清髓性allo-hsct，预处理方案为bucy方案，常规方法预防移植相关并发症。(3)取供者、患者移植前、移植后第7天(+7d)、+14d、+28d、第2个月(+2m)、+3m、+

3、6m，+gin和+12m外周全血标本各5ml，其中4ml采用磁性激活细胞分离器(magnetic activated cell 501t盯，macs)分离法进行分选后，分别纯化出t淋巴细胞和粒细胞，连同lmi全血进行pcr扩增，检测其短片段重复序列(shorttandem repeats，strs)，了解患者移植后外周全血、外周血t淋巴细胞和粒细胞的嵌合状态，观察后两者形成嵌合体的时间早晚、植入的速度快慢及其在复发、gvhd发生和免疫抑制剂调整等临床事件中的变化规律。结果：l例接受非清髓性allo-hsct的患者于+7d和+14d均为混合嵌合体(mixed chimera，mc)，t淋巴细胞的

4、嵌合比例较粒细胞高，分别为27和14(+7d)及7l和63(+14d)，于+28d外周全血、外周血t淋巴细胞和粒细胞达到完全供者嵌合状态(complete donor chimclim，cdc)。其余5例接受清髓性allo-hsct的患者粒细胞较t淋巴细胞植入快，嵌合比例的中位值分别为50(2878)和23(1332)，于+14d均达cdc。例2和例3分别在+lom和+9m发生慢性gvhd(chronic gvi-id，cgvhd)，进行s1rpcr检测，外周全血、外周血t淋巴细胞和粒细胞仍处于cdc。给予免疫抑制剂后，2例患者临床表现及肝功能检查均较前好转1例于移植后+60d复发，外周血t细

5、胞供者成分降低的百分比多于粒细胞，分别为24和15，同时骨髓象亦提示复发。结论：1检测经磁性激活细胞分离器(macs)分离法分选后的t淋巴细胞和粒细胞的嵌合体是可行的。2allo-hsct后，定期监测外周血不同系列细胞的嵌合状态可以早期判断是否植入和预示移植后复发，给予相应的临床干预治疗，可以改善预后关键词：造血于细胞移植，异基因，嵌合体，短串联重复序列(str)山西医科大学硕士学位论文abstractobjecfive：to analyse chimerism kinetics of t lymphocytes and granulocyte from peripheralblood aft

6、er allogene haemopoietic stem cell transplantafion(allo-hsct)and its imphcation inthe occmrence of posttransplant relapse,grafi vasus host disease(gvhd)and regulation ofimmunodepressantmethod：6 patients wcrc diagnosed as acute or chronic leukemia and treated with ailo-hsctduring april and october in

7、 2006 in our deparunenlthe patients with acute leukemia wcle inthe first complete remission(crl)and the ones winl chronic leukemia wc_e in the first chronicphase(cpl)，ofwhich,oneunderwentnonmyeloablativeconditioningregimen,theothersunderwent myeloablative one,and was given conventional way in order

8、to prophylaxiscomplication correlated with transplantationall blood samples were taken from aii patients atdifferent intervals following transplantationthe quantitative determination of chimerism inperipheralbloodand t lymphocyt韶and granulocyte from peripheral blood seperated bymagnetic activated ce

9、ll seter(mac鼬was performed using short tandem repeats and polymerase chain reaction(str-pcr)the chimerism l【i饿蛹cs of lineage-specific chimerismwas observed,and their changed rule in the occurl锄dce of postwansplantation relapse,gvhdand regulation ofimmonedepressant was also studiedresult：in one patie

10、nt receiving nonmyeloablative conditioning,the chimerism of t lymphocytewas higher than granulocyte on day 7(+7d)and 14 posttransplant and were 27and 14(+7d)and 71and 63(+14d)respccfivdyall achieved cdc 011 day 28in other five patients givenmyeloablative conditioning,the chimerism of grenulocyte was

11、 higher than t lymphocyte on+7dposttrausplant,and theft median donor chimcri懿fl were 5000(2800-78)and 23(13-32)all achieved cdc on+14din month 9(恸n)and+10re,chronic gvhd(cgvhd)happended onno2 and 3,and the chimerism in peripheral blood,t lymphocyte and grenulocyte wdlg stillcdcafteradjustion of iram

12、unodepressant,their clinical manifestation and examination inlaboratory webetter than beforeno5s disease replased on+60d,and the decreased donorproportionof t lymphocytewasmorc thanthatof granulocyte，andshewasnotacccpcdtreatment againmedian follow-up time for patients alive(n=4)was 10(712)monthsconc

13、lusion：it is feasible to detect the chimerism of tiymphocytes and granulocyte separaledusing macsmonitor chimerism of cells from different series in penpheral blood sequentially山西医科大学硕士学位论文may judge engraftment。or not earlier and signify posttransplant relapse，and give correspondingclinical interven

14、tion so as to improve prognosis，key words：hematopoietic stem cell wanspiantation,allogeneic，chimerism,short tandem repeats(strs)m山西医科大掌硕士学位论文刖吾随着造血干细胞移植在临床上的广泛开展，造血嵌合体目前成为许多移植中心常规的检测项目，利用str的多态性结合pcr(short tandem repeats and polymcrase chain reaction，s霸cr)进行嵌舍体的检测仍是目前最常用的判断移植成败的方法。检测造血嵌合体，最初选择的标本是外周

15、全血，通过对自身细胞的监控，判断患者的嵌合状态，可对移植后复发进行早期检测，有助于在临床复发前，采取措施加以预防【但外周全血是一个由多种细胞成分组成的混合体，不同系列细胞尤其是白细胞的各亚型均有其各自的生物学特征，如生存时间的长短、执行功能的差异等，它们形成嵌合体的动力学及其与疾病复发、移植物抗宿主病一20x109l，所有血制品均给予60co 25gy照射粒缺发热患者先经验性给予广谱抗生素，待细菌鉴定加药敏实验结果回报后给予敏感抗生素治疗。复方新诺明(smzc0)预防卡氏肺囊虫感染。4)供者造血干细胞的输注(donorsperipheralblood stemcellinfusion，dsi)

16、l例接受非清髓异基因外周血干细胞移植的患者，在移植后35天予以dsi，mnc为1o107kg。5)移植后植入物的检测及随访观察(1)植入物的检测血液学植入：连续3d#f周血anc05109l，将其首日定为血液学植入；分子植入：全血细胞嵌合体供者信号占优时，称分子植入【lll，定期复查str-pcr；血型：供、受者血型不合时，从第3个月起每月复查1次血型，至转为供者型；性染色体：供、受者性别不同时，每23个月复查1次染色体(2)疾病本身标志物检测移植后+14d进行骨髓穿刺术，复查骨髓象、染色体和融合基因急性白血病前6月每月复查一次骨髓，612月每3月复查一次，1224月每6月复查一次cml患者每

17、3个月复查1次骨髓、ph染色体和bcrabl融合基因(3)移植相关并发症的观察hcmvpcr检测，每周1次直至术后2月；观察皮肤、口腔、眼部、肺部、肝脏及造血系统等临床表现，监测移植物抗宿主病(gran versus host disease，gvhd)(4)临床干预措施免疫抑制剂的调整：根据临床表现、疾病本身实验室检查和嵌合体的测定结果调整免疫抑制剂。2str检测1)标本采集取供者、患者移植前、移植后第7天(+7d)、+14d、+28d、第2个月(+2m)、+3m，+6m、+gin和+12m#f周全血标本各5ml，acd抗凝。2)细胞分选，磁性激活细胞分离器(macs)分离法采用cd3、cd

18、l5免疫磁珠试剂盒，按照试剂盒说明书进行t淋巴细胞及粒细胞的分选纯化t淋巴细胞的分选：(1)免疫磁珠的洗涤：将小管中的免疫磁珠摇匀悬浮；取出所需量的免疫磁珠到试管中，按每毫升样本中加入25x107,i-磁珠，即50m；加1-2ml pbs或10fcsrpmll640培养液并混悬好；将试管放进磁性细胞分离架中1分钟，用吸管吸弃上清；用等量缓冲液混悬洗涤过的免疫磁珠。(2)细胞分离(阳性分选)准备单个核细胞：将外周血用pbs稀释2倍，小心加在比重为1077的淋巴细胞分层液上，s山西医辩大学磺士掌位论文分层液事先放在离心管中，与稀释血体积比为1：2，2000转分离,l,20分钟，吸取界面层即得单个核

19、细胞，计数。用pbs(ph 74，含01bsa)或rpmi10fcs混悬细胞为lxl07pbmcm1将混悬好免疫磁珠的试管放在磁性细胞分离架中，吸去上清，加入单个核细胞悬液，每毫升样本中加a25107个cd3标记的磁珠(即50id)，拿起试管(离开磁场)，轻轻旋混几秒钟。将免疫磁珠和样本放在28c孵育20分钟，旋转混合。将试管放在磁性细胞分离架上分离l一2分钟。待磁珠结合的细胞到达试管壁后用吸管轻轻地吸弃上清。从磁性细胞分离架上移开试管，加入1-2ml pbs或rpmi10fcs到与磁珠结合的细胞中，轻轻混合、洗涤，尽量使磁珠脱离细胞的丢失减少到最低。将试管放在磁性细胞分离架上12分钟，用吸管

20、吸弃上清重复、两步清洗2次。洗完后，加rpmi10fcs混悬磁珠结合的细胞。粒细胞的分选：将外周血用pbs稀释2倍，小心加在比重为1077的淋巴细胞分层液上，分层液事先放在离心管中，与稀释血体积比为1：2，2000转分离一tj,20分钟，吸取红细胞以上、单个核细胞层以下的粒细胞层，后用cdl5标记的免疫磁珠进行纯化(3)将分选后的cd3和cdl5阳性细胞经流式细胞仪测定纯度。3)dna的提取所有血样均用5chelex-100快速提取dna。试剂配方：59cholex置于100ml无菌双蒸水中混匀。操作程序：(1)取适量血样放于05ml离心管中，12000转分离心3分钟，弃上清；(2)加入200

21、1al 5chelex-100提取液，振荡混匀后放于56(2恒温水浴箱中保温30分钟；(3)沸水浴8lo分钟；(4)漩涡振荡5lo秒后，放于离心机中12000转分离心3分钟后上层液体备用。4)dna的定量模板dna的量直接影响到pcr的扩增效率，5ng可产生off-scale峰，从而影响供者嵌合体的定量结梨1引31故dna量控制在05ng5ng之间用紫外分光光度计测定dna浓度，调整dna终浓度为osng：。2山西医辩大学硬士学位论文8c短期保存dna，-20长期保存。5)pcr扩增str位点dna样本使用ampfstr identifilcr pcr扩增试剂盒(16个str位点)进行复合扩增

22、。取lo山扩增反应体系，其中包括pcr反应混合液38m，荧光标记的引物混合液2m，taqgoldtm dna聚合酶o2m(5ui_d)，模板dna4pj(dna量控制在n55ng)稍加离心后置pcr扩增仪中进行扩增，热循环参数为：预变性95c11rain；pcrj广增94clmin，59cimin，72imin，28个循环；最后60保温45rainpcr产物避光4保存每次pc对。增均包括阴性对照及阳性对照(已知位点的dna标准品)6)pcr产物的分离与检测abi 310遗传分析仪采用pop-4胶及47cm长毛细管进行全自动毛细管电泳及片段分析。取15山扩增产物、o5mq娜sc盟-500 rox

23、pij标、24山去离子甲酰胺于15m检测样本管中，充分混匀，稍离心，置95变性3min后，迅速置冰水中保温至少3min，用47cmx50cm毛细管，pop-4液态胶，lox310 ga缓冲液，在60恒温、15kv电压条件下，于abi 310型基因分析仪中自动进行电泳分离并检测。用gentscan31分析软件，根据rox-500i勾标准确计算出dna扩增片段碱基长度，读出峰下面积值；c把notype21根据dna片段长度及等位基因梯ladder阅读各位点的基因型。7)计算供体细胞嵌合率(donor chimcdsm，dc)根据供受体基因型的差异，选择嵌合体计算公式r|“61代入峰下面积值计算dc

24、百分比，供体嵌合率为所有不同i类位点dc的均值。嵌合体的界定11-q：移植后受者血细胞样本基因型转变为供者型或供者dna成分所占比例975。称为完全供者嵌合(complete donor chinlerinl，cdl=)；若移植后血细胞样本基因型既有供者型又有移植前受者型，称为混合嵌合(n淑ed chimera，mc)。山西医科大学硬士学位论文结果与分析istr-pcr的检测结果l，l供、受者的有效基因座位取患者移植前和供者dna样本。根据人群中常见的16个str基因座分布特点及基因座多态性，供、受者至少存在1对具有分辨意义的str臣点6例患者平均有115(714)个有效基因座位结果见表11表

25、l-1供、患者有效的str基因座位病例l23456基因座d2islld8s1179患者30，31214，15供者29厅01315基因座d7s820csfipo患者s，1210，14供者12lo12基因座csfipo1h0l患者10，12们供者lo2，126基因座d3s1358d13s317患者16，189，12供者15，169，lo基因座d13s317d2s1338患者lo12l嘣供者1219陀5基因座d16s539yf沥患者91216，17供者lo，12l蚴基因座d2s1338d18s5l患者18，191315供者19彪215，2d基因座d19s433fga患者14215223陀5供者131

26、425基因座i，胴amn患者l彰17x供者16，17x基因座11，ox患者ll堡耋!坐dssll79d8s1179131415，1612，1310，15d21s1ld2lsll29 29，3222彰3329d7s820d7懿2012 9，lolo，12lo，llcsflpocsflpo9，1210，121112i0133$1358d3s1358161515，171516d13s317tholll 79li127，13d16s539d13s3178，129，llil3，10d2s1338d2s133823，241820忍318陀0d19s433d19s433l影14l彰1421314214215

27、矿搏弹矿翩16，1314!型!：!dssll79dgsll7915，1610，1314，161315d2lslld12isii29303l岛22312乃22d7s820csfipo11121113111111old3s1358715，177917d16s539d16s539912912 912d18s5ld2s1338132l18陀l14，1521，25am盼d19s433x，142x1314r彤t14，1617，18可pox9，ll9d18s51l“15!三!l山西医车太掌硬学位诧x基因座d18s51d18s51tpoxfga患者14171319911123供者1215141981 l202

28、5基因座d5s818d5s818d18s5|amg患者10l!121419xy供者101312131321x基因座fgafgaamg患者23242025x供者2123222xy基因座amgamg患者xx供者xxi2外周血细胞的分选纯化将患者移植后不同时间点抽取的外周全血用macs分离法进行t淋巴细胞、粒细胞的分选纯化部分标本经流式细胞仪测定纯度，结果见表l-2、图ll和图l-2-表1-2分选后t淋巴细胞和粒细胞的纯度()检测标本l2345t细胞9539519794596o粒细胞949896，496595813外周全血、外周血t淋巴细胞和粒细胞str的检测结果外周全血、分选后的外周血t淋巴细胞和

29、粒细胞str的检测结果见表l-3、图1-3图l8表1-3外周全血、分选后的外周血t淋巴细胞和粒细胞弼t的检测结果()病例标本+7d+14d+28d+2m+3m+6m+9m+12mlpb1865100100loo1002m啪mmt控阻t粒m以裾啪啪瑚mmm啪m3，5m椭椭m骼拍t粒阻t粒踞t珥勰坶弘b勰盯：合毋s：m啪m啪啪m100100loo塾!塑!塑墅山西医科大学硕士学位论文2外周血t淋巴细胞、粒细胞嵌合体的临床意义21外周血t淋巴细胞、粒细胞的嵌合动力学例1接受非清髓性预处理方案，+7d和+14d均为mc，t淋巴细胞的嵌合比例较粒细胞高，分别为27和14(+7d)及7l和63(+14d)，

30、于+28d外周全血、外周血t淋巴细胞和粒细胞均达到cdc。其余56例患者接受清髓性预处理方案，粒细胞较t淋巴细胞植入快。+7d嵌合比例的中位值分剐为50(287s)和23(1332)，于+14d均达cdc22分子植入与血液学植入l例患者分子植入时问为+7d，其余5例患者分子植入时间为+7d+14d所有患者均获造血重建，中性粒细胞绝对计数(absolute neutrophil counts，anc)o5109l的中位时间为移植后第13天(+13d)(+11d+15d)；2例患者分别于+6d和+7d anc降至0，发生率为26，4例患者于+6+8 d anc降至最低值。分别为o04、o03、00

31、5、004，c109i,4例患者于+8+17d(中位时间为+125d)血小板(platelet，bpc)20109l；其余2例患者分别于+lo和+6dbpc降至最低值，分别为341和33x109l。2例患者anc降至0同时bpc降至20x109l以下，发生率为26如表2-2。表22血液学植入情况病ancbpc例匿禚石_夏丽呖5覃舀舂蟊百匿爵面j石j磊了瓦丽20109l时间2，3外周血t淋巴细胞、粒细胞的嵌合状态与gvhd6例患者均未发生急性gvhd(acutegvhd，agvhd)。例2于移植后第lo个月(+10m)出现全身皮肤色素沉着增多、丘疹性红斑，眼干、眼异物感及肝功能损害；例3于移植后

32、+9ln出现眼干、眼涩，口腔粘膜水疱、进食困难及肝功能异常。进行smpcr检测，夕周lo山西医科大学硕士学位论文全血、外周血t淋巴细胞和粒细胞仍处于cdc。两例均给予常规保护肝脏等对症治疗1个月，未见明显效果，故考虑为慢性gvi-id(chronic gvhd，cgvhd)所致的肝功能损害。后加用美卓乐(甲基强的松龙)20ragtall，治疗1个月后例2皮肤损害、眼部症状较前减轻，肝功能检查有所好转；例3口腔疼痛、眼涩渐减轻，丙氨酸氨基转移酶(alt)由最高的400ul逐渐降至230ul。24外周血t淋巴细胞、粒细胞的嵌合状态与复发例5于移植后+60d复发，str结果显示外周血t细胞供者成分降

33、低的百分比多于粒细胞，分别为24和15，同时骨髓象亦提示复发讨论近年来，allo-hsct成为治疗恶性血液病最有效的手段，甚至是治愈某些类型白血病的唯一方法，移植后虽然临床上外周血象的恢复，尤其是anc和bpc的回升，可以提示受者造血功能的恢复，但不能证明受者的造血功能已完全被供者取代，利用str-pc瞄行嵌合状态的动态监测至关重要1实验方法的改进aiio-hsct后进行嵌合状态分析，以往的研究主要检测外周全血标本，其中占多数(5080)的粒细胞对检测结果影响较大，而在移植排斥、gvhd和gvl中起关键作用的t淋巴细胞，因其所占比例较少，嵌合状态很可能被掩盖。近年来的研究亦发现：由于预处理和免

34、疫抑制方案的不同，供者不同系列的细胞在患者体内的植入并不同步；而在疾病复发时，受者不同系列细胞的重新出现也不完全同步，而且可能表现出不同的病理生理过程【堋因此，与分析各系列血细胞的嵌合状态相比，全血的针对性较差我们的研究采用磁性激活细胞分离器(macs)分离法即用cd3、cdl5抗体标记的免疫磁珠(immunomagnetie beads，imb)进行t淋巴细胞和粒细胞的分选纯化，此方法所获细胞纯度高(9399)。获率可达900a，活细胞率大于95；分离效果与流式细胞术相当甚至更好，但比后者省时且费用低，操作简单埘。为研究外周血不同系列细胞的嵌合状态创造了条件。2t淋巴细胞和粒细胞的嵌合动力学

35、国内外学者就t淋巴细胞和粒细胞的嵌合动力学进行了一些研究，但由于众多影响因素的存在，至今还没有一致意见有学者的研究结果显示：供者t细胞的完全植入最早，随后是其它系列，粒细胞是最后的转化系列13201；与此结果相反，另一些学者则发现：t细胞获取完全供者嵌合状态落后于粒细胞221万理萍等1的研究结果为：在同一时间点，421例患者粒细胞的嵌合比例比t淋巴细胞的多，1721例患者则相反，但2021例患者粒细胞达cdc的时间早于t淋巴细胞李大启等241的实验结果与此类似：清髓性allo-hsct后lo d(+10 d)，55例患者的粒细胞迅速演变为完全供者嵌合体(cdc)，+14 d，45例患者的t细胞

36、获得cdc；非清髓auo-hsct，+7d+14 d，供者t细胞的植入速度快于粒细胞：随后，供者粒细胞的比例突然增加，并迅速获得cdc，t细胞的植入却渐缓慢，最后，t细胞取得cdc的时间迟于粒细胞13,2q我们的研究结果为：在同一时间点，5例清髓性allo-hsct患者外周血粒细胞的嵌合比例比t淋巴细胞高，于+14d均达cdc：l例非清髓性auo-hsct患者外周血t淋巴细胞嵌合比例较粒细胞高，植入较慢，于+28d均达cdc。但是，仅仅t淋巴细胞和粒细胞植入的早晚不能决定它们形成cdc的先后，两者植入的快慢亦是一个很重要的因素，这在上述学者的研究中得到了体现。分析我们的研究结果可以看出，在清髓

37、性移植的嵌合体形成过程中。5例患者于+7d均处于mc，但粒细胞与t淋巴细胞的嵌合比例相差较大，于+14d两系均迅速达到cdc，与李大启等嗍报道一致。在非清髓性移植的嵌合体形成过程中，+14dt淋巴细胞与粒细胞嵌合比例相差的明显较+7d小，推测其可能的原因是+7d之后，t淋巴细胞形成嵌合体的速度逐渐减慢，而粒细胞逐渐增快，两者的差距越来越小，于+28d前两系细胞嵌合比例有一交点，正如国内文献报道。但是我们的检测时问间隔较长(14天)，没有观察到这一交点。3预处理方案与t淋巴细胞和粒细胞的嵌合状态预处理方案是造血干细胞输入受着体内之前的处理措施，其主要目的有抑制免疫、腾空位置和杀灭恶性克隆【lj。

38、因此，移植前预处理方案对移植结果的影响至关重要。预处理方案究竟能否影响各系列细胞形成嵌合体的规律，上述国外文献没有明确的比较。国内有学者认为：预处理方案不同，各类型细胞的植入速度差别较大洲还有学者的研究证明：清髓与非清髓移植组的t淋巴细胞达到cdc的中位时间分别为21d，28d，后者较前者晚，但两组差异无统计学意义；两组粒细胞达到cdc的中位时间均为14d阿我们的结果与前者相同，非清髓移植t淋巴细胞和粒细胞达到cdc的时间比清髓性移植迟2周，但由于病例数少，无法进行统计学分析。另外，childs等【31和matts$on等221均研究非清髓移植后t淋巴细胞和粒细胞的嵌合状态，但两组研究得出的结

39、论刚好相反。同一疾病，同样的预处理方案，移植后同一时间检测嵌合状态，mc中供者来源细胞的比例随着药物剂量的增加而递减阅。可见，关于预处理方案及其用药剂量如何影响嵌合体的形成过程，还需进一步研究。4gvh与t淋巴细胞和粒细胞的嵌合状态移植后能否成功植入是我们首要关注的问题，如上所述，不同的预处理方案可能涉及到的早期植入细胞不同。而成功植入后，移植相关并发症的监测亦是决定移植成败的重要方面gvhd是all0hsct的主要并发症和造成死亡的主要原因，agvhd主要表现为皮疹、腹泻、黄疸，cgvhd表现为多器官损伤和器官系统功能减退的自身免疫样综合征，治疗相当棘手，因此研究与gfid相关的细胞系列的嵌合状态具有很重要的