发明专利模板

1、一株发酵产黑色素的枯草芽孢杆菌及发酵产黑色素的方法技术领域： 本发明属于生物工程发酵技术领域， 具体涉及通过枯草芽孢杆菌液体发酵生产黑色素及 提取方法 。背景技术： 黑色素是一种广泛存在于生物体中的一类天然色素，是酪氨酸经过一连串的化学反应 形成的， 通常以聚合的方式存在。 黑色素可以作为吸收紫外线的化妆品成分、 天然染发剂的 成分、 以及生物杀虫剂的光保护剂尤其是应用于化妆品， 因其具有吸收紫外线的作用， 可以 保护皮肤；色素有很多重要的生物学功能 , 它能通过与蛋白质的交联起到强化结构的作 用, 同时黑色素还能提供一些机械力 , 并且保护蛋白质不被降解； 此外黑色素在医学上也具有 很广的应

2、用范围，具有清除自由基、 阻止心磷脂脂质体的氧化、抗辐射及抗氧化、 对病理学 和分类学的研究具有重要意义、 作为新型的天然药物载体、 用来治疗某些与黑色素缺乏相关 的神经性疾病 , 例如白癜风是常见的一种由于黑色素的缺失而引起的一种疾病。目前， 黑色素既可以通过酪氨酸或其衍生物的氯化进行化学合成，也可以从动植物材料中提取， 还可以利用微生物合成， 但现在大规模生产黑色素仍以化学合成法为主。 例如一种 以哺乳类动物的毛发为原料和一种以黑芝麻味原料， 用氢氧化钠溶液浸提后采用盐析作为沉 淀剂使黑色素沉淀来制取黑色素的方法。 但随着人们对以化学原料合成黑色素安全性问题的 认识，现越来越倾向于对天然黑

3、色素的开发和应用。 尤其倾向于用微生物液体发酵生产黑色 素。天然黑色素安全性高， 成分确定可操作性强， 尤其是采用微生物发酵生产黑色素具有反 应条件温和、 操作简单、 低成本等特点。 现在国内对利用微生物发酵生产黑色素的研究还较 少，本发明是利用枯草芽孢杆菌液体发酵生产黑色素。发明内容：本发明针对现有黑色素合成工艺的不足，提供一种利用微生物液体发酵生产黑色素并 提取的方法。本发明所用菌株为枯草芽孢杆菌 * ( )现已保藏在中国微生物菌种保藏委员会 普通微生物中心(CGMQC保藏编号为*本枯草芽孢杆菌 * ( )属于革兰氏阴性菌 本发明的技术方案：通过枯草芽孢杆菌的液体发酵生产黑色素，其过程包括

4、菌种的斜 面培养、种子液培养、摇床发酵培养、深层液体发酵培养和黑色素的提取。本发明的具体步骤为 :(1) 发酵菌种的准备：取保存在-80 C的枯草芽孢杆菌接种于于固体培养基中，划线培养，培养温度3638C,培养时间4872h，挑取单菌落作为种子菌。固体培养基的配制方法：成分为蛋白胨1g、葡萄糖o.1g、NaCI0.5g、CaCl2 O.OIg、L-酪氨酸0.1g、琼脂粉1.5g，然后用去离子水定容到100ml，调节PH为7.0 ,最后在温度121 C、高压蒸汽灭菌1520min，冷却制得固体平板。(2) 种子液发酵培养：将固体平板菌接种于种子液中，在温度3638C、转速181r/min ,培养

5、1216h,培养至对数期。种子液的配制方法：成分为蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、NaCl1g然后用去离子水定容至100ml，调节PH为7.0，分装到若干个250ml摇瓶中，在温度121 C、高压蒸汽灭菌1520min , 冷却得到种子液。(3) 将种子液进行放大培养：取上述(2)种子液按接种量 6%(V/V)接种于发酵培养基中，在温度36C38C、转速181r/min 培2226h,然后加入 L-酪氨酸0.1g/100ml，再继 续培养 20 30h。发酵培养基制备： 成分为氮源 1.5%2.5%、碳源 1.5%2.5%、NaCl0.4g、KH2PO4、MgSO4.7H2O 0.02g、KNO1

6、g、( NH) 2SO 1g、玉米粉1g,然后用去离子水定容到 100ml，调节PH为7.0 , 在温度121 C、高压蒸汽灭菌 20min制得发酵液。上述( 3)中发酵液：氮源可为酵母膏、尿素中的一种或多种。碳源可为麸皮、蔗糖、乳糖中的一种或多种。深层通风液体发酵培养：（ 5）发酵液中黑色素的提取：发酵结束后将枯草芽孢杆菌黑色素发酵液过滤或者离心除去菌体，取发酵液浓缩，用 5mol/LHCI调pH值至23，充分振荡,静置40100min，在搅拌的同时加入等体积有机溶 剂使其充分沉淀，用滤布过滤弃上清，得黑色粗提物，于50C真空干燥至恒重。所述发酵液离心转速为 50008000r/min，离心

7、10min，除去菌体。所述有机溶剂为无水乙醇、无水甲醇或无水丙酮中任意一种。所述有机溶剂为浓度 40%100%的乙醇。所述黑色素发酵液的浓缩比为50%。所述静置可以为恒温水浴中静置，水浴温度为0 C100C。所述水浴温度优选为 80 C。本发明制备黑色素的优点：本发明方法制备的黑色素具有安全、简单、高效等优点。在 化妆业、工农业、医药业具有广泛的应用前景。 产自枯草芽孢杆菌的黑色素降低的生产能耗、 缩短的生产周期、对环境危害小，于国家倡导的可持续性发展相结合。具体实施方式：下面结合具体事例对发明做详细介绍：本发明所用菌种为枯草芽孢杆菌 * （ ）现已保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心

8、（CGMC）保藏编号为*本枯草芽孢杆菌 * （ ）属于革兰氏阴性菌实施例一、种子液的培养（1）发酵菌种的准备：取保存在 -80 C的枯草芽孢杆菌菌种于固体培养基中，划线培养，培养温度36 C38 C，培养4872h，挑取单菌落作为种子液菌种。固体培养基的配制方法：成分为蛋白胨1g、葡萄糖o.1g、NaCI0.5g、CaCb O.OIg、L-酪氨酸0.1g、琼脂粉1.5g ,然后用去离子水定容到 100ml,用NaOH或HCL调节PH为7.0 ,在 温度121 C、高压蒸汽灭菌1520min，冷却制得固体平板。（2）枯草芽孢杆菌种子液培养：将固体平板菌接种于种子液中，在温度3638C、转速181

9、r/min，培养1216h，培养至对数期。种子液的配制方法：成分为蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、NaCI1g然后用去离子水定容至 100ml, 用NaOH或HCL调节PH为7.0，分装到2个250ml摇瓶中，在温度121 C、高压蒸汽灭菌 1520min,冷却得到种子液。实施例二、 摇瓶发酵培养取上述枯草芽孢杆菌种子液按接种量6% V/V）接种于发酵培养基中，在温度36 C38C、转速181r/min 培2226h，然后加入 L-酪氨酸0.1g/100ml，再继续培养 2030h。发酵培养基制备：成分为氮源1.5%2.5%、碳源 1.5%2.5%、 NaCl0.4g 、 KH2PO4、MgSO7

10、H2O0.02g、KNO1g、（ NH4） 2SQ1g、玉米粉1g,然后用去离子水定容到 100ml，调节 PH为7.0，在温度121C、高压蒸汽灭菌 20min制得发酵液。上述发酵培养基中： 源可为酵母膏、尿素中的一种或多种。 碳源可为麸皮、蔗糖、乳糖中的一种或多种。实施例三、深层通风液体发酵培养实施例四、发酵液中黑色素的提取发酵罐装液量为15L，接种量为6%(V/V),溶氧量20%,37C 181r/min，在24h后加入 L-酪氨酸 0.1g/100ml 培养 2-3d。发酵结束后将枯草芽孢杆菌黑色素发酵液过滤或者离心除去菌体，取发酵液浓缩，用5mol/LHCI调pH值至23，充分振荡,静置40100min，在搅拌的同时加入等体积有机溶 剂使其充分沉淀，用滤布过滤弃上清，得黑色粗提物，于50C真空干燥至恒重。所述发酵液离