前列腺免疫组化

1、材料和方法实验材料(一) 研究对象收集前列腺癌标本。选取同时期前列腺增生标本，标本均经病理科专家确 诊，所有患者术前均未接受放疗、化疗或激素治疗，且各组年龄间无显著性差 异。(二) 实验仪器及试剂1、主要实验仪器电热恒温水浴箱微波炉微量进样器冰箱电磁炉电光分析天平切片机光学XX及XX系统2、主要试剂(1) HIF-la鼠抗人单克隆抗体，购于北京中杉金桥生物技术有限公司(2) SP超敏试剂盒，购于北京中杉金桥生物技术有限公司(3) DAB酶底物显色剂试剂盒，购于上海长岛生物技术有限公司二、实验方法及步骤本实验采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶连接 (streptavidin peroxi

2、dase, SP法，即S-P法。在一位经验丰富实验技术人员的指导下进行。具 体实验过程及操作方法如下 :(一)免疫组化切片制备将干净载玻片浸入硫酸重铬酸钾混合液中过夜，自来水冲洗后用蒸馏水反 复清洗三遍，烘干 ;置 50%的乙醇中过夜，再次用蒸馏水清洗三遍，烘干 ;将烘干 玻片在 1:50 的明胶海绵中浸蘸，烘干后备用。将石蜡包埋的组织标本连续定向切片三张，厚度 4gm, 1张HE染色，2张处 理后用于免疫组化染色，附于处理的载玻片中央，于60C烘箱处理后备用。(二)免疫组化SPxx染色步骤常规SP法染色检测HIF-la按试剂盒提供的操作步骤进行：(1) 梯度酒精常规脱蜡水化(2) PBS冲中

3、洗 5min,共 3 次(3) 微波处理修复抗原 ：将切片放入有构椽酸缓中液容器中,置微波炉中加热,温度保持92-98C,水开沸腾 10分钟,自然冷却至室温 ;(4) 每张切片加一滴或 50u1 过氧化氢阻断溶液,以阻断内源性过氧化酶的活 性,室温孵育 10 分钟 ;(5) PBS冲中洗 5min,共 3 次；(6) 每张切片加一滴或 50u1 非免疫性动物血清,室温孵育 10分钟;(7) 每张切片加一滴或 50u1 的鼠抗人 HIF-1 a；(8) 4 C冰箱孵育，次日复温一小时；(9) PBS冲中洗 5min,共 3 次；(10) 每张切片加一滴或 50u1 生物素标记的二抗，室温孵育 3

4、0min;(11) PBS冲中洗 5min,共 3 次；(12) 每张切片加一滴或 50u1 链霉素抗生物素一过氧化酶溶液，室温孵育 30min；(13) PBS冲中洗 5min,共 3 次；(14) 每张切片加2滴或1 OOul新鲜配置的DAB溶液，室温下避光显色3-1 Omi n,显微镜下控制发应时间，流水冲洗，终止反应；(15) 苏木素复染,盐酸酒精分化,自来水中洗蓝化 ；(16) 梯度酒精常规脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。(三) 对照观察(1)阴性对照 :以PBS代替一抗作空白对照。(2)阳性对照:己知肝癌切片作为阳性对照。(四) 结果判定HIF-la阳性染色主要表现为细胞浆内呈现棕色或棕黄色颗粒；先按染色强度打分:无色 0 分,浅黄色 1 分,棕黄色 2 分,棕褐色 3 分；再按阳性细胞所占百分 比打分:阳性细胞数 76%为 4 分。每张切片以阳性细胞百分率和染色程度两项得分乘积作为最 后得分:0-1分为阴性一” ,2-3分为弱阳性“+,45分为中等阳性“ +,(分以上为 强阳性“+ +”