肝脏蛋白质组计划的实施与毒理学发展的机遇

1、编辑ppt1 国际肝脏蛋白质组学研究国际肝脏蛋白质组学研究 计划的实施与毒理学发展机遇计划的实施与毒理学发展机遇 编辑ppt2 蛋白质组学产生的时代背景 “人类蛋白质组计划”的目标与意义 蛋白质组学与毒理学/环境医学 编辑ppt3 曼哈顿原子弹曼哈顿原子弹 研制计划研制计划 人类基因组计划人类基因组计划 阿波罗登月计划阿波罗登月计划 人类历史上的三大科技工程人类历史上的三大科技工程 1941.12.61945.7.16 罗斯福批准罗斯福批准, 耗资耗资20亿美元亿美元 原子半径原子半径 10-10m 原子体积原子体积 10-30m3 人体半径人体半径 100m 人体体积人体体积 100m3 太

2、阳系半径太阳系半径 1012m 太阳系体积太阳系体积 1034m3 1990.10.1-2003.4.23 克林顿、布莱尔批准，克林顿、布莱尔批准， 耗资耗资30亿美元亿美元 1961.5.251969.7.20 肯尼迪批准肯尼迪批准, 耗资耗资240亿美元亿美元 编辑ppt4 人类基因组计划开创了人类基因组计划开创了 “基因组时代基因组时代” 编辑ppt5 基因组学向基因组学向 蛋白质组学蛋白质组学 “求助求助” ! Nature 409:747, 15 Feb. 2001 And now for proteome “现在轮到蛋白质组现在轮到蛋白质组” Science 291:1221, 1

3、6 Feb. 2001 Proteomics in Genomeland “基因组大地中的蛋白质组学基因组大地中的蛋白质组学 ” 编辑ppt6PROTEINPROTEIN 编辑ppt7 转录组转录组 一种细胞、组织或生 物体所对应的全套全套 mRNA RNA RNA 基因组基因组 生物体所拥有的 全套染色体上的 全部基因 DNADNA 蛋白质组蛋白质组 一种细胞、组织或生 物体所对应的全套蛋 白质 PROTEINPROTEIN 功能执行体功能执行体遗传信息载体遗传信息载体 编辑ppt8 基因和蛋白质并不存在严格的线性关系基因和蛋白质并不存在严格的线性关系 ORF并不预示一定存在相对应的功能性基

4、因并不预示一定存在相对应的功能性基因 mRNA水平并非与蛋白质的表达水平对应水平并非与蛋白质的表达水平对应 翻译后修饰及同工蛋白质翻译后修饰及同工蛋白质 (Isoforms) 等现象在基等现象在基 因水平无从表现因水平无从表现 蛋白质与蛋白质的相互作用难以在基因水平得以蛋白质与蛋白质的相互作用难以在基因水平得以 认识认识 基因组与转录组不能取代蛋白质组基因组与转录组不能取代蛋白质组 编辑ppt9 翻译后修饰翻译后修饰 相互作用相互作用 构象变化构象变化 翻译后拼接翻译后拼接 移位移位 胞质 胞核 蛋白质调节的多样性蛋白质调节的多样性生命的生命的“万花筒万花筒” 编辑ppt10 蛋白质功能的群体

5、性蛋白质功能的群体性 编辑ppt11 绳绳 墙墙 扇扇 茅茅 蛇蛇 树树 蛋白质作用的整体性蛋白质作用的整体性 编辑ppt12 探索生命奥秘的直接对象探索生命奥秘的直接对象 蛋白质组蛋白质组 生命体的统一性源于基因组生命体的统一性源于基因组 生命体的多样性、复杂性、生命体的多样性、复杂性、 功能性、表型源于蛋白质组功能性、表型源于蛋白质组 1 46 3-4 x 104 3 x 109 103 (1012) 编辑ppt13 n Proteomics seeks to provide functional information for all proteins. n proteomics is

6、more of a concept than a defined technology, and it refers to any protein-based approach that has the capacity to provide new information about proteins on a genomewide scale. n“Proteomics includes not only the identification and quantification of proteins but also the determination of their: n loca

7、lization n modifications n interactions n activities n function 编辑ppt14 蛋白质组学产生的时代背景 “国际人类肝脏蛋白质组计划”的目标与意 义 蛋白质组学与毒理学/环境医学 编辑ppt15 DNA序列图序列图基因图基因图 人类基因组中人类基因组中1/3以上以上 基因未曾确认基因未曾确认 基因确认的基本层次基因确认的基本层次- 蛋白质水平蛋白质水平 天书天书 解读天书解读天书 Science 291:1221, 2001 编辑ppt16 全面揭示重大疾病发生发展机制的基础全面揭示重大疾病发生发展机制的基础 蛋白质组蛋白质组 单

8、基因病单基因病遗传病遗传病 多基因病多基因病肿瘤等肿瘤等 重大疾病发生发展机制重大疾病发生发展机制 单一基因单一基因单一蛋白单一蛋白 基因群基因群蛋白质群蛋白质群 转录组转录组蛋白质组蛋白质组 ? ? ? ? 编辑ppt17 发现大量新型药靶与新药的源泉发现大量新型药靶与新药的源泉 蛋白质组蛋白质组 最重要的疾病最重要的疾病 100 - 150 每种疾病相关的基因每种疾病相关的基因 10 每个基因相关的蛋白质每个基因相关的蛋白质 3 10 药靶蛋白总数药靶蛋白总数 3000 - 15,000 现有药物约现有药物约2000种种85是针对目前已知的是针对目前已知的500种药靶种药靶 6-30倍药靶

9、有待发现倍药靶有待发现 编辑ppt18 探索人体生命奥秘的直接对象探索人体生命奥秘的直接对象 全面揭示重大疾病发生发展机制的基础全面揭示重大疾病发生发展机制的基础 发现大量新型药靶与新药的源泉发现大量新型药靶与新药的源泉 人类基因组序列及基因注释人类基因组序列及基因注释 编辑ppt19 验证人类基因组计划推测的基因，注释基因组 阐明蛋白质组的调控模式并与转录组进行对比 建立蛋白质群/组装体，蛋白质复合物或蛋白质 机器, 即连锁图 建立人体生理学、病理学的蛋白质组基础 编辑ppt20 1 46 3-4 x 104 3 x 109 103 (1012) 基因组计划基因组计划 蛋白质组计划蛋白质组计

10、划 编辑ppt21 编辑ppt22 Body fluid most accessible for biomarker discovery in animal and humans. Liver Kidney OrganBody Fluid Brain Immune Organs/Vessels Intestine Other Tissues CSF Feces Endocrine/Paracrine Secretions Bile Urine Air/BALF Lymph Lungs Eyes Skin Oral Cavity Sweat Saliva Tears Venous Blood A

11、rterial Blood Serum 10 % 90 % Serum Proteins Non-Informative Abundant Proteins i.e. albumin, IgG, etc. Informative Low Abundance Proteins Enrichment Strategies for Informative Serum Proteins: SELDI Serum Immunosubtraction 编辑ppt23 人类肝脏蛋白质组人类肝脏蛋白质组 计划里程碑计划里程碑 蛋白表达谱蛋白表达谱 蛋白连锁图蛋白连锁图 亚细胞定位图亚细胞定位图 修饰谱修饰谱

12、遗传图 物理图 序列图 编辑ppt24 Initiatives of Human Proteome Project (HPP) HPPP Human Plasma Proteome Project, USA HLPP Human Liver Proteome Project, China PSI Proteomics Standards Initiative UK HBPP Human Brain Proteome Project, Germany HAI Human Antibody Initiative Sweden 编辑ppt25 Why is liver? wwwww.HLPP.HUP

13、O 为何研究肝脏为何研究肝脏? ? 编辑ppt26 能量能量转换、储存 物质代谢（活性分子的合成、 毒性分子的分解） 信息信息分子的合成与分泌 编辑ppt27 组织的活力依赖于高能键的连续生成。 肝脏产生大部分脂肪酸，后者是禁食状态下能 量的基本来源。 肝脏是给食状态下由过剩糖合成脂肪酸的主要 部位。 编辑ppt28 药药 物物 毒毒 物物 营养物营养物 生物异源物生物异源物 生物转化生物转化 编辑ppt29 1.2107种以上的化学物 (CA Services list) 以每周约8000种的速率增加 常用化学物在63,000种以上 大约 11,500种，作为食物或药物制剂添加物摄入 其余的

14、50,000种，为潜在的环境污染物 编辑ppt30 造血系统的发育必需肝脏的造血系统的发育必需肝脏的“培育培育” 编辑ppt31 合成和分泌血浆蛋白是肝脏实质细胞肝细胞的独 有功能（肝细胞占肝脏总细胞数的60% 及肝脏质量的约80%） 最有特征的血浆蛋白是白蛋白，在大多数哺乳动物中 占总血浆蛋白的55-60% 凝血酶、抗凝因子、溶栓酶等 编辑ppt32 机体再生能力机体再生能力 最强的器官最强的器官 终生保持旺盛终生保持旺盛 的再生能力的再生能力 编辑ppt33 Metabolic genomics Metabolome (代谢组) Energy genomics Energome (能量组)

15、 Pharmacogenomics Pharmacome (药理组) Toxicogenomics Toxicome (毒理组) Regenerating genomics Regenerome (再生组) 编辑ppt34 全球: 3.5亿携带者 中国: 1.8亿携带者 死亡: 23万人/年 疾病负担: 500亿元人民币 治疗手段: 抗病毒,保肝降 酶,抗纤维化,免疫治疗等 缺点: 病毒易反弹,病 情易反复 编辑ppt35 全世界现有3.5亿慢性乙肝病毒（HBV）携带者，占世界人口的5%，亚洲和非 洲HBV携带率为8-15% HBV携带者中50-70%病毒复制活跃，为慢性乙肝 慢性乙肝病人肝硬

16、化发生率为2-20%，代偿性肝硬化发展成失代偿性肝硬化 为20-23%，发展成肝癌的占6-15% 中国的慢性乙肝病人中，约25-40%最终将死于肝硬化或合并肝癌 HBV携带者最终死于相关肝病的危险性，男性为50%，女性为15% 编辑ppt36 全球: 100万人/年 中国: 50万人/年 死亡: 约45万人/年 疾病负担: 400亿元人民币 治疗手段: 手术切除(只有 15%-20%) 治疗效果: 术后易转移,易复 发 , 五 年 存 活 率 40-50% 全球及中国肝癌的流行病学统计全球及中国肝癌的流行病学统计 编辑ppt37 世界上每年有100万新发原发性肝癌病人，其中40-50%在我国

17、我国原发性肝癌发病率和死亡率均位居第二位 近20年来我国肝癌的发病率上升近40% 原发性肝癌一般起病较隐匿，早期缺乏典型临床表现，初诊大多 已属中晚期 初诊肝癌病人中，只有15-20%的病人具备手术条件 这些病人术后5年生存率仅为40-50% 肝癌是致死率最高的恶性肿瘤之一 编辑ppt38 重大肝病的发生发展无法归咎于少数几个基因或重大肝病的发生发展无法归咎于少数几个基因或 蛋白质所呈现的功能状态和信号通路蛋白质所呈现的功能状态和信号通路 从蛋白质组层面上从蛋白质组层面上“全景式全景式”揭示揭示肝脏疾病的生理肝脏疾病的生理 病理机制病理机制是解决重大肝病的根本出路是解决重大肝病的根本出路 肝炎

18、病毒肝炎病毒肝脏肝脏/肝细胞肝细胞肝炎肝炎 肝硬化肝硬化/纤维化纤维化原发肝癌原发肝癌肝癌转移肝癌转移 多因素、多因素、 多步骤的发病机制多步骤的发病机制 编辑ppt39 编辑ppt40 Prometheus stole fire from the gods and gave it to mortals. Prometheus Bound Heracles Liberate Prometheus HLPPModern HLPPModern Prometheus MythPrometheus Myth PrometheusPrometheus LiverLiver Eagle Liver dis

19、eases Eagle Liver diseases Heracles HLPPHeracles HLPP 编辑ppt41 国际HLPP共同体 编辑ppt42 Generate an integrative approach leading to a comprehensive functional map of the liver Expand liver proteome to its “PHYSIOME” and “PATHOME” to dramatically accelerate the development of diagnostics, prevention and ther

20、apeutics towards its diseases Develop standard operating procedures (SOPs) for other HUPO Initiatives VISION 编辑ppt43 HUPO Workshop, Bethesda, April 28-29, 2002 Broad interests and supports for initiating HLPP HUPO Liver Proteome Workshop, Beijing, October 22-24, 2002 Getting consensus view for scien

21、tific objectives of HLPP HUPO 1st World Congress, Versailles, November 21-24, 2002 Co-chairs of HLPP: Drs. Fuchu He, John Bergeron and Christian Brchot HLPP Planning Committee: 17 members; May 2003 Proposals about Working Plan of HLPP Dr. John Bergeron: Jan 31, 2003 (Management); Dr. Fuchu He: Feb 1

22、7, 2003 (Scientific Strategy) Dr. Fuchu He: Mar 22, 2003 (Action Plan); Dr. Christian Brechot: Mar 31, 2003 (Sampling) HLPP Office, March 18, 2003 HUPO LPP Workshop, Bethesda, July 17-18, 2003 NIH participating HUPO 2nd World Congress, Montreal, Oct. 8-12, 2003 Dr. Fuchu He was appointed as the exec

23、utive Chair of HLPP (2003-2005) HUPO HLPP Satellite Meeting, Montreal, Oct.12, 2003 Set up Executive Committee DeltaCn0.1; RSp4. nABI-TOF/TOF Protein score59 (Rank 1 for the spot) nQ-TOF or Q-STAR Protein score threshold Peptide score “the score for identity” or 29 nMALDI-TOF Protein score threshold

24、 The proteins in first report (multi-protein for the mixture) 编辑ppt60 Evaluation of technologies Bioinformatics set-up Sampling and preparation Preview with human fetal liver Primary analysis of French liver tissues 编辑ppt61 Object: Find the optimum method of pretreatment Sample: Liver tissues of C57

25、 mice Subcellular: Mitochondria, Golgi, PM, Nucleus, ER, Cytoplasm Sample pretreatment Fresh tissues Frozen homogenised tissues Frozen tissues 编辑ppt62 Purity (Western blotting): Fresh tissues frozen homogenized tissues frozen tissues The yield of proteins: Fresh tissues frozen homogenized tissues fr

26、ozen tissues Integrity (TEM): Fresh tissues frozen homogenized tissues Summary 编辑ppt63 Evaluation of technologies Bioinformatics set-up Sampling and Preparation Preview with human fetal liver Primary analysis of French liver tissues 编辑ppt64 It is a giant ambitious objective and gives a great challen

27、ge to embryonic proteomics It is necessary to carry out a preview before the formal launching of this project Science 302:1316, Nov. 21, 2003 Nature 425: 441, Oct. 2, 2003 编辑ppt65 Average Throughput of the Platform 2DE System 12 Gel / 3 Days Auto-Spot Digest System 1152 spots / Day MS and MS/MS Syst

28、em 500-1000 Spots / Day 编辑ppt66 编辑ppt67 The area scales before and after isoform processing in group and protein levels respectively. In protein level, the red circularity areas represent the number of confirmed proteins and the yellow annulus areas represent the number of possible proteins. Non-iso

29、 groups 19% Extensively confirmed 81% Groups 41% Confirmed 59% Non-isoforms 43% Isoforms 57% contribute 545 additional proteins and eliminate 763 groups contribute 545 additional proteins and eliminate 1335 possible proteins In Protein Level In Group Level confirmed: 1950 possible: 2593 extensively

30、confirmed: 2495 non-isoform possible: 1258 编辑ppt68 0 20 40 60 80 100 120 140 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y Chrom osom e Number of proteins KrKRAB A C B 编辑ppt69 编辑ppt70 Evaluation of technologies Bioinformatics set-up Sampling and Preparation Preview with human fetal li

31、ver Primary analysis of French liver tissues 编辑ppt71 Reference Labs for HLPP Expression Profiling Project Fuchu He & Xiaohong Qian (Beijing Institute of Radiation Medicine) Rong Zeng (Shanghai Institute for Biological Sciences) Pengyuan Yang (Fudan University) Siqi Liu (Beijing Genomics Institute, C

32、hinese Academy of Sciences) 编辑ppt72 Laura Beretta (FHCRC, USA) Richard J. Simpson (Royal Melbourne Hospital, Australia) Angelika Gorg (Technische Universitat Munchen, Germany) Mark Baker/Junhong Sun (APAF, Australia) 编辑ppt73 Background Progress of the HLPP Initiation of the CNHLPP Next work 编辑ppt74

33、The first phase : 2004-2005 Funding from central government: 10 million US dollars Chinese MOST: jointly funded by National Program on Key Basic Research Projects (973), National High-tech R&D Program (863), and National Key Technologies R&D Programmein in the first phase. Local and Institutional fu

34、nding: 3.5 million US dollars 8 subprojects 70 institutes, universities, and companies involved Long-term support as a national project (20062020) 编辑ppt75 Celebration of CNHLPP Official Launching (Beijing Institute of Radiation Medicine) 编辑ppt76 Key labs Beijing Institute of Radiation Medicine 编辑ppt

35、77 Consulting committee (5) ORFeome & PPI Subproject, Zeguang Han Chair Fuchu He Headquarters BPRC Modification Profile subproject, Yun Cai Expression Profile Subproject, Xiaohong Qian Structural Biology Subproject, Weimin Gong Bioinformatics subproject, Yixue Li New Technology subproject, Yukui Zha

36、ng Antibody subproject, Qi-Hong Sun Localization Mapping Subproject, Xuemin Zhang 编辑ppt78 More than 10 workshops have been held 编辑ppt79 Protein modification Protein localization Protein structure New proteomics technologies 编辑ppt80 m/z m/z m/z 编辑ppt81 O60716 GSLApSLDpSLRKP15924 GLPSPYNMSpSAPGpSR O75

37、379NLLEDDpSDEEEDFFLRRApSpSKGGGGYTC*QSGSGWDEFT K O95210HSpSWGDVGVGGSLKP16157RDpSRDVDEEKELLDFVPK P02671ADpSGEGDFLAEGGGVRP35221TPEELDDpSDFETEDFDVR P02730 YQpSSPAKPDSSFYK Q13813WRpSLQQLAEER YQSSPAKPDSSFpYK Q15019IYHLPDAEpSDEDEDFKEQTR YQSSPAKPDSpSFYK Q16828SNIpSPNFNFMGQLLDFER RYQSSPAKPDpSSFYK Q99959RLEIS

38、PDpSpSPERAHYTHSDYQYSQ R P04792GPpSWDPFR LPEEWSQWLGGSSWPGYVRPLPPAA IEpSPAVAAPAYSR Q9H3Z4SLpSTSGESLYHVLGLDK Tr:O95810SLEETLHTVDLpSpSDDDLPHDEEALE DpSAEEKVEESR P05386KEEpSEEpSDDDM*GFGLFD KEEpSEEpSDDDMGFGLFDTr:Q8NEN5pSQpSLPTTLLSPVR P08559YHGHpSMSDPGVSYRTr:Q9HAP4 ESEALPEKEGEELGEGERPEEDAAAL ELpSpSDEAVEVEEV

39、IEESR P11277TpSPVSLWSR LpSpSSWESLQPEPSHPYTr:Q9NQA7WLDEpSDAEMELR Identified phosphopeptide sequences from HFL 编辑ppt82 Protein isolation and purification by lectin (Glycosylation) 编辑ppt83 Co-localization and locomotion of the GFP fusion protein and DsRed DsRed-Mem Green merge GFP GFP-fused Pr TNF- tre

40、ated GFP-fused mutant TNF- treated GFP-fused Pr 编辑ppt84 Cloned 900 genes from liver Expressed products of more than 100 genes Determined the structures of 3 proteins by X-ray Determined the structures of 2 proteins by NMR 编辑ppt85 Diphosphoglycerate mutase (DPGM) X-ray Programmed cell death 5 (PDCD5)

41、 NMR 编辑ppt86 Beijing (National) Proteome Research Center Chinese Proteome Development Center 编辑ppt87 The Antibody Bank of Human Liver Proteome Project Establishment, characterization, and application of antibodies against human liver proteins Qi-Hong Sun Beijing Institute of Radiation Medicine (BIRM

42、) Beijing Proteome Research Center (BPRC) 编辑ppt88 AntigensMyeloma cellsHybridoma cells mAbs DiagnosticsTherapeuticsProteomics Research Profiling Identification Quantification Localization Modification Interaction Function Large antibody collection for proteomics 编辑ppt89 Antibody Database Antibody Ba

43、nk Samples HLPP Antibody Bank 编辑ppt90 10% of HLPP Antibody Bank Standards and database of HUPO HLPP/HAI Microarray and other antibody-based technology 90% 10% HLPP Antibody Bank at Pilot Phase 编辑ppt91 Antigen preparation Fractionated liver proteins - Unknown/native/multi-antigens Recombinant protein

44、s Synthesized peptides Antibody generation Hybridoma cell lines mAbs (murine/rabbit) Polyclonal antibodies IgG (Rabbit)/ or IgY (chicken) Antibody characterization and application Class and subclass, ELISA, IH, WB, and IP Antibody microarray and other antibody-based technology General Approach 编辑ppt

45、92 AdultFetalDiseased IH characterization of mAbs against human liver proteins 编辑ppt93 Progress summary of HLPP Antibody Banking Project Antigen preparation for immunization Fractionated liver proteins nucleus, membrane, microsome, mitochondrial, cytosolic, and plasma proteins Purified recombinant p

46、rotein antigens 215 Synthesized peptides from liver-specific proteins 44 Antibody preparation and characterization Established hybridoma cell lines 1085 Characterized mAbs 862 for more than 100 different proteins Rabbit pAbs 50 Antibody Application Depletion of high-abundant proteins Immunohistochem

47、istry Isolation of protein complexes 编辑ppt94 Labs of HLPP Antibody Banking Project National (China): Qi-Hong Sun/Jianen Gao, Ming Li, Min Zhao, Daling Zhu, Chaoneng Ji, Gang Cheng, Zhinan Chen, Boquan Jing, Jian Wang/Lin Wu, Xiaoning Wang/Ying Lin, Zheng Li, Jinliang Yang, and Jie Tang. Internationa

48、l collaboration: HUPO-HAI (Dr. Uhlen) FHCRC/NCI-IBDC (Dr. Lee) German Systems Biology Project (Drs. Meyer, Ueffing) 编辑ppt95 Working plan Antibody datasheet Electronic submission form Antibody list Website/HLPP Antibody database Antibody demands/applications Antibody quality control Antibody exchange

49、, collection, and distribution Scale of antibody bank Antibody-based technology International collaboration 编辑ppt96 编辑ppt97 Background Progress of the HLPP Initiation of the CNHLPP Next work 编辑ppt98 Distribute the Chinese specimens to reference labs outside China Establish the SOPs for the black rac

50、ial peoples liver sample Comprehensively analyze the data of the proteins expressing profile of the French specimens Establish the SOPs for the protein-protein interactions and ORFeome Initiate virtually diseased liver proteome subproject Initiate virtually proteomic modification and localization su

51、bprojects 编辑ppt99 Continue to discuss the cooperation with other initiatives (e.g. MRPP, HPPP, PSI, HAI, etc.) or other programme (e.g. Systems Biology Project of Germany) Establish the headquarters of the HLPP Continue to propagandize the HLPP to the public and private domains Strive for more finan

52、cial supports from more resources 编辑ppt100 Jun. 3, Washington Organizer: Laura Bereta Jun. 10, EBI/LondonOrganizer: Rolf Apweiler Aug. 27, Munich Organizer: Fuchu He 编辑ppt101 蛋白质组学产生的时代背景 “人类蛋白质组计划”的目标与意义 蛋白质组学与毒理学/环境医学 编辑ppt102 揭示环境因素的致病机制 了解化学毒物的代谢途径 解析微生物蛋白质组组成 增强疾病预防诊断与治疗 编辑ppt103 Genetics Influ

53、ence Environment GenomicsTranscriptomics 2-DE/MSICAT-LC/MS Information Flow DNAm-RNAProtein Protein species 2 Protein species 2 Protein species n Ribosome PTMsProtein species 1 Protein species 1 Protein species 2 Proteomics 编辑ppt104 基因（组）基因（组）环境因素环境因素 蛋白质（组）蛋白质（组） 疾疾 病病 蛋白质组学系统研究机体的蛋白质变化蛋白质组学系统研究机体的蛋白质变化 揭示环境因素对人体的致病机制揭示环境因素对人体的致病机制 生物因素生物因素 化学因素化学因素 物理因素物理因素 编辑ppt105 The mission of the intramural Proteomics program within the National Center for Toxicogenomic