登革2型病毒浙江分离株的鉴定与分子流行病学研究.

1、登革 2 型病毒浙江分离株的鉴定与分子流行病学研 究登革病毒 (Dengue virus,DV) 是黄病毒属的一个血清学亚群 , 它包括 4 个不同的 血清型,引起的登革热 (Dengue fever,DF) 是一种急性发热性传染病 , 这种疾病 有时发展成登革出血热及登革休克综合征 (Dengue hemorrhagic fever, DHF 或 Dengue shock syndrome, DSS), 常可导致患者死亡。登革热的流行是热带和亚 热带地区一个严重的公共卫生问题 , 亚热带地区至少基金项目 : 浙江省科技厅重 点项目(2001136) 作者单位:浙江省疾病预防控制中心 (杭州

2、310009) 作者简介 : 夏时畅(1962 ), 男,浙江富阳人 ,副主任医师 ,中心副主任 , 主要从事传染病流行 病学研究。有 8 个国家流行该病。登革出血热是引起儿童住院和死亡的十大原 因之一,自 1978年以来,我国南方就发生了 7次流行,它严重危害着人们的健 康。浙江省在 1929 年发生过一次登革热流行 1,间隔 76年后,于 2004 年 7-10 月又由泰国输入病例引起浙江省本地 113 例登革热病例的局部流行。 2004 年 10 月浙江省杭州市又报告了 1 例输入性疑似登革热病例。为了对该病例及时 做出实验室确诊 ,分析毒株的基因变异和种系进化特征 , 从分子水平追踪传

3、染源 , 我们采集了患者血清标本 , 进行了登革热血清学、病原学和分子生物学特征研 究。1 材料与方法1.1 患者及标本来源 周某某,2004 年 10月 8日从马尔代夫归国 ,发病前曾在 该国居住了 1个月左右,10 月 12日高热不退 ,在浙江大学医学院附属第一医院 就诊,无法诊断,然后转至杭州市第六人民医院 (传染病医院 )就诊,主要临床表现 为发热、头痛、肌痛伴淋巴结肿大。从马尔代夫大使馆得知 , 当时马尔代夫流行 登革热。 10月 12日采集患者第 1份血清,10 月 17 日采集第 2 份血清,带冰运送 到实验室。1.2 血清抗体测定 登革热IgM和IgG抗体测定采用ELISA和间

4、接免疫荧光试 验(IFA),ELISA和IFA试剂分别购自广州市中山生物工程有限公司和中国疾病 预防控制中心病毒病预防控制所 , 实验均按试剂盒说明书进行。1.3 病毒分离 采用C6/36和BHK-21细胞分离患者早期血清样本中登革病 毒。C6/36细胞株从广州市疾病预防控制中心获得,BHK-21细胞由本实验室液氮 保存复苏。病毒分离按常规方法进行 1。1.4 病毒RNA提取 采用德国QIAGEN司的RNeasy mini Kit, 按照试剂盒说 明书进行,取血清标本或病毒分离阳性物 200 1提取病毒RNA最终收集RNA提 取液30卩l 。1.5 病毒核酸检测和型别鉴定 采用登革热型特异性荧

5、光RT-PCF方法进行核 酸检测和型别鉴定2,本实验室对荧光RT-PCR方法的特异性、敏感性和重复 性均进行了验证。引物和探针由上海博亚生物科技有限公司合成。1.6 RT-PCR扩增E基因和NS1基因。引物设计：参照GenBank登革2型病毒核苷酸序列设计引物。E基因测序引物为:Den-2(E)F1:AAC ATG GAT GTC ATC AGA AGG; Den-2(E)R1:CCA ATC TTG TTA CTG AGC G扩增片段为 1850 bp。 NS1 基因测序引物为:Den-2(NS1)F1:AGT GGG GTY TCA TGG ACT ATG; Den-2 (NS1) R1:

6、 TTA GGC TGC TAG TAG GGC AAG扩增片段为 1440 bp。引物由上海 博亚生物科技有限公司合成。 RT-PCF采用Roche公司的Titan one tube RT- PCR Kit进行。反应体系为50卩l,反应液组成：双蒸水19.5卩l、dNTPmix (10 mmol/L) 4 卩 l、DTT (5 mnol/L) 2.5 卩 l、RNase inhibitor(5 U)1卩 l、上游和下游引物(20 卩 mol/L)各 1卩 l、5X RT- PCR buffer 10 卩 l、Emix 1 卩 l、RNA提 取液10卩l。反应条件为:50 C 40 min逆转

7、录,94 C 2 min后,94 C 30 s、51T 30 s、68C 2 min,循环 35 次，68 C延伸 7 min,然后转入 4C。取 RT-PCR 产物5卩l,用1.5%琼脂糖凝胶电泳，根据Marker位置确认反应产物。1.7 DNA序列测定和分析采用PCF扩增产物纯化后直接测序，委托上海博亚 生物科技有限公司完成测序工作。数据处理采用 DNASTARMEG等软件进行同 源性和进化分析。2 结果2.1 登革病毒抗体和核酸检测应用ELISA法和IFA分别检测疑似患者血清标本中登革病毒 IgM 和 IgG 抗体, 结果第 1 份血清抗体均阴性 , 第 2份血清中登 革病毒 IgM 和

8、 IgG 抗体均阳性 (表 1)。 IFA 试验在荧光显微镜下可见明显的胞浆 内黄绿色特异性荧光颗粒(图1)。同时,用登革病毒型特异性荧光 RT-PC肪法， 在第 1 份血清中检测到登革 2 型病毒核酸。 A. 疑似病人血清样本 ; B. 阴性对照 图 1 疑似登革热患者血清标本 IFA 试验结果2.2 病毒分离 用C6/36和BHK-21细胞对疑似患者第1份血清标本进行登革 病毒分离 , 样本接种细胞后 , 在第 1 代均出现细胞病变 (CPE), 在 C6/36 细胞上其 特征为细胞膨大至融合，折光度增强，颗粒增多(图2);在BHK-21细胞上CPE出 现较慢 , 至少在接种样本后 5 d

9、 才能观察到局灶性病变 , 特征为细胞变小、变圆 和聚集。对C6/36细胞阳性分离物提取病毒 RNA后采用登革病毒荧光RT-PCF方 法鉴定,结果登革2型出现明显的“ S型曲线峰图，登革1、3、4型、正常细胞 对照和阴性对照均没有出峰 , 型别鉴定为登革 2 型病毒。2.3 核苷酸序列测定 对 C6/36 细胞上分离的浙江省登革 2 型病毒分离株 (ZJ/01/04)提取病毒RNA后,经RT-PCFT增E基因和NS1基因，经测序获得E 基因全长 1485 bp,NS1 基因全长 1056 bp, 未发现有碱基的缺失和插入 ,2.4 进化树分析 为了进一步分析浙江省登革 2 型病毒分离株 (ZJ

10、/01/04) 与不 同国家病毒分离株E基因和NS1基因的生物进化关系，采用邻位相连法构建进化 树(图4,5)。从图中可见ZJ/01/04株E基因的氨基酸与Saudi/92株的同源性 最高,亲缘关系最近,在进化树的同一分支上；NS1基因氨基酸进化树显示ZJ/01/04 株与 Fujian/10/99 株关系最近。3 讨论 浙江省输入性疑似登革热病例的主要临床表现为发热、头痛、肌痛、关节痛、 皮疹伴淋巴结肿大。对该病例采集不同发病日期的血清样本进行实验室检测 , 结 果在第 1 份血清中检测到登革 2 型病毒核酸 ； 在第 2 份血清中检测到登革 IgM 和IgG抗体；用C6/36和BHK-21

11、细胞从第1份血清中均分离到登革2型病毒。 在血清学和病原学上均证实该输入病例是由登革 2 型病毒引起。通过对这起输 入病例的实验室检测 , 值得我们注意的是 , 对发病不同时期采集的样本 ,选择合适 图3浙江省登革2型病毒分离株与国内外部分毒株 E基因全长氨基酸序列比 较 蛋白系统进化树的检测方法是非常重要的。发病早期的血清样本 , IgM 抗体阴性, 且同时具有疑似疾病相应的临床症状和流 行病史时 , 必须考虑用敏感特异的方法检测病毒核酸 ,这样可以达到早期诊断 , 并 尽早对患者采取有效的隔离等控制措施 ,防止传染病 2 代病例的发生 , 甚至引起 该地的局部流行。登革病毒包膜蛋白E由E基

12、因所编码，位于病毒毒粒表面3； 构成毒粒的突起 , 是主要结构蛋白 , 决定着登革病毒的组织亲嗜性 , 并介导 病毒与细胞受体的结合 4, 同时还是影响登革病毒毒力 , 引起保护性免疫应答 及免疫病理损伤的重要成分 5,6, 可诱导特异性的保护性中和抗体。此 外,NS1蛋白含有群特异和型特异的抗原决定簇，在病毒分型上有重要意义，亦可 刺激机体产生高滴度的保护性抗体。因此,本研究对ZJ/01/04株进行E基因和 NS1基因的核苷酸序列测定，并进行同源性和进化分析，结果显示浙江省登革2 型病毒分离株E基因和NS1基因与登革1、3、4型毒株E蛋白氨基酸的同源性 分别为 68.7%、 66.9%和 6

13、3.6%, 与登革 2型国际标准株 Jamaica 和 Fujian/10/99 株的同源性分别为 97.1%和 99.2%,而与 Saudi/92 株的同源性最 高 , 达 99.6%。ZJ/01/04株E蛋白和NS1蛋白均含有2个糖基化位点,与所比较的登革2型毒 株糖基化位点相同。目前所发现的登革病毒的毒力基因大多在E区。据报道，登革2型病毒E蛋白相关毒力位点为E71(D)、E126(K)和E203(N)等7 9,浙 江省的ZJ/01/04株E蛋白相关毒力位点分别为 E71(A)、E126(E)和E203 (N), 这些位点与文献报道的有毒株不完全一致 7 9 , 其生物学意义有待进一步阐

14、 明。此外，从E基因进化树显示，ZJ/01/04 株与Saudi/92株的亲缘关系最近， 在进化树的同一分支上。在 NS1基因进化树上，ZJ/01/04株与Fujian/10/99 株 具有很近的亲缘关系，由于GenBank中无近几年Saudi Arabia 登革2型株NS1 基因的登录,因此,无法与其比较。从ZJ/01/04株E基因和NS1基因同源性和种 系进化树分析显示 , 该流行株最有可能来源于沙特阿拉伯。登革病毒的传播在东 南亚一带已有很久的历史 ,4 种血清型登革病毒引起的登革热疫情呈周期性暴 发。自 20 世纪 50 年代以来 , 东南亚一带每年都有很多登革热和登革出血热的病 例报告, 登革热疫情早已被证实在当地形成地方性流行 10,11 。目前, 在我国虽然尚未形成登革病