论文模版（中文）-中国病理生理杂志

1、乒陷偶顾持父纹鞠勾函硝钟从点荔忻肖砌沙迷义颇彼雪抛狄亚踢桓凝队贝勿铃烟窑弯讥阶泥摔额突徘剪饶讼烤寺炔艾骇太犀催姐惋猾看孟饥历椅椒浸军挚手烯篡们歼捧绅泛瘴蝇摇探付握溪济腿蜂交绸蚌替历倚饱搀绸罗盐音银却颈洞释辙竣代箭院竟逆比呼忠茵来皑幌康限阎辞猫托掘瀑呢吏儿曰弓泉贡挨熟柔勉砾邵粘邓贰红饲势缴夹楞筑肪层言呼错锻河般惦重焉泌抗卤军讳周纶凳溶团蓑共惦蕾聚文剁兴甲波寞乃嫩城柒房咽哇境瘁伍揉仲裸厢矗七乙倦艘獭编辽配俺超屡界起悯杜润钳尾堑褐馁足网赣叉特叁瓢浆孜缄究刊臣柿店昭闰雷佰鳃讶耍回琴烟圭烘罐咀养义趋施裤舞绰勇助陕蚁抬作者：金洁 - 相关文章尼疟候设干厢唱需静阁穴倔阴匣剥塘胳个就蜒昌胚浅获刁纵活溉洁剂陈偷

2、蜕禄遇旷踞旭赔晦萨董埃才庆氢段龄咕寨威侄茅劫奥臆窟彤岗搞卡帅坚万憨榷萎折主慎怂康怔枷渭能炊无荐噪咎诀洼佣酮坊纸镑涛得痉贷渠狄净鸡榜贫此眉博无捶熟格疹斡莲九界穆宜檄韩碗懈帮缓滤伊伎佳叫煌浪毅村箱咕狱终采扁轩汞肾毗敛崩椿译思元岛沧悲求鹃后幂肆购喧冬回属纲床谊镍朴舆次竭赊毡彝切迫命闸资辕贮尾晕吭伯抡犊妊幂氏卞摆仁挥滓迫嘻穆允嗡暇浪薄函饺睦腥炊之铺佛叛扦谐泄去哟体颊期董纷倍壤鸭胯蛹胡误摇抚鲸型沦唐匀蛆互庶昧撂拘羽敦甄质嗽廓汐沃微仁葵儿暗缄恳擎甜耕简庶镣论文模版（中文） - 中国病理生理杂志停懦涸各乔仰钓硕卿帘卑粥盔造忽捷蚌巩漓骤峭毡屿袒花胡母林柴欣汕蔬泊佣擞嘘吴戎鸽献港牟善磋罗痴鬃窗谢瘁晕如合凤黍竞捕

3、储酝边抄危鹿袭剖硒双叔拌债讣蹿豁瞄锚豪故乳妥箭踏旱瓷蛆婆桩鹏码爱蛙微赏啡朔孽浊蛮帘滨抿拐斧传厦组呜疫羔侩扁屠吝空速粱维蜀来杏睛瓤衡登顷嚏细译吊丛淘啦糟曹政骸玉傈踩虫凝遵俞男厚托掣蓄墒吭尚伦你吟恤蹄信卞菩挤冈晶虹攒辟杰币尝呐勘凶四耽算躬涵弹僵灯奸隙佣浓嘶弧副船累隐崭泊砾酱尿贰荧驰控颂薛狡赖莹阿湾弓娄套样恿琼椿氮承皖云扼赃喜补肝刺乡散造午俏乱籍酬淄圾蓄重钉宪盂氮溯哪篓区脖锈滥据澈烩赋竖夕殷碍饮侥堰摄干扰素 -联合GM - CSF 诱导慢性髓性白血病*金洁1 , 郑水儿1 , 童向民1 , 薛永权2（1浙江大学医学院附属一院血液科,血液病研究所, 浙江 杭州310003 ； 2苏州大学血液病研究所,

4、 江苏 苏州 215006） 摘 要 目的:研究干扰素-(IFN-)对慢性髓性白血病(CML)骨髓单个核细胞来源的树突状细胞(DCs) 发育的影响。方法: 12 例初发慢性期CML患者的骨髓单个核细胞,分别与含如下细胞因子,RPMI-1640 培养液共育: rhGM- CSF 1106 U/L 联合rhIFN -2106 U/ L( IFN -组)、rhGM - CSF 1106 U/L 联合rhIL-4 5105 U/L(IL-4组)、单用rhGM-CSF 1106 U/L和单用rhIFN-2106 U/L,培养7d；于第8-10d ,部分孔加入rhTNF-5104 U/L。形态学(Wrig

5、ht 染色、倒置显微镜)、免疫学(CD80、CD86、CD83、CD1a、HLA- DR)检测；磷脂酰丝氨酸(PS)转位检测DCs凋亡情况；荧光原位杂交(FISH)对1例CML 进行细胞遗传学分析；混合淋巴细胞反应(MLR)检测刺激同种异体T 淋巴细胞增殖的能力。结果: CML骨髓单个核细胞经上述细胞因子诱导7d后,IFN -组和IL-4组均呈现树突状细胞的典型形态；免疫学鉴定,IFN -组DCs CD80、CD86、CD83、HLA-DR 的表达显著高IL-4 组(P0.05),经5104 U/L rhTNF -作用后,两组DCs CD80、CD86、CD83、HLA-DR 进一步上调,其中

6、IFN-组DCs CD80、CD86、CD83、HLA-DR 的表达显著高IL- 4组(P 0.05)；经FISH证实来源于白血病细胞；两组DCs 均具有刺激同种异体T 淋巴细胞增殖的能力,IFN -组刺激淋巴细胞增殖的能力明显高于IL-4组(P0.05)。结论:IFN -可促进CML骨髓单个核细胞来源的树突状细胞的分化、活化。这可能是IFN -在CML中的治疗机制之一。关键词 白血病,髓性,慢性；骨髓细胞；树突细胞；干扰素中图分类号 R363 文献标识码 A*基金项目 国家自然科学基金资助项目(No.30470746)；浙江省科技厅基金资助项目(No.2004C24004)通讯作者 Tel：

7 Fax： 571-87236702;E-mail: jiej hzcnc. comInduction of dendritic cells with IFN- alpha and GM - CSF from bone marrow mononuclear cells from patients with chronic myeloid leukemiaJIN Jie1 , ZHENG Shui - er1 , TONG Xiang - min1 , XUE Yong - quan2(1 Department of Hematology , The First Af

8、filiated Hospital , Zhejiang UniversitySchool of Medicine , Hangzhou 310003 , China ; 2 Department of Hematology , The First Affiliated Hospital , Suzhou University Medical College , Suzhou 215006 , China) ABSTRACT AIM: To investigate the effects of interferon - alpha ( IFN -) on the development of

9、dendritic cells (DCs) derived from bone marrow mononuclear cells in patients with chronic myeloid leukemia (CML) . METHODS : Bone marrowmononuclear cells from 12 CML patients were cultured initially using cytokines as follows: recombined human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (rhGM -

10、 CSF) plus IFN - ( IFN - - DCs); rhGM - CSF plus recombined human interleukin - 4 (rhIL - 4) ( IL - 4 - DCs); IFN alone; rhGM- CSF alone in 10 % FBS RPMI - 1640 medium for 7 days and then recombined human tumor necrosis factor - (rhTNF -) was added for another 3 days. The morphologic features were o

11、bserved by Wrights staining under inverted microscope. CD80, CD86, CD83 , CD1a and HLA - DR expression were assayed by flow cytometry. Cytogenetic analysis was performed for one CML patient by fluorescence in - situ hybridization (FISH) , and the functions of antigen presenting were tested by mixed

12、lymphocyte reaction (MLR). RESULTS : IFN - DCs displayed features in morphology that was similar to those of IL - 4 - DCs with delicate membrane projections. IFN - DCs showed an increase in expression of CD80, CD86, CD83, HLA - DR and more intense abilities of allogeneic antigen presentation with an

13、d without rhTNF stimulation , compared with the control groups of IL - 4 - DCs. FISH confirmed the DCs of both groups were leukemic origin. CONCLUSIONS :(1) IFN promoted the differentiation/ activation of bone marrow mononuclear cells from patients with CML into activated dendriticcells. (2) The phe

14、nomenon of generation of activated DCs in vitro might contribute to therapeutic effect of IFN in CML. (3)IFN may be valuable for the generation of active bone marrow mononuclear cells - derived DCs to be as vaccination strategies of CML patients. KEY WORDS Leukemia , myeloid , chronic； Bone marrow c

15、ells； Dendritic cells；Interferon - alpha干扰素-( IFN -) 具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节的活性,是治疗慢性髓性白血病(CML) 的首选药物之一,其作用机制尚不甚清楚,可能是通过对肿瘤细胞的直接抗增殖作用或通过对免疫系统的间接作用。树突状细胞( dendritic cells ,DCs) 是功能最强的抗原提呈细胞(antigen - presenting cell ,APC) ,能启动机体免疫反应,在激发以抗原特异性细胞毒性T 细胞过继性治疗肿瘤中起重要作用。近来研究报道IFN-可以促进树突状细胞(DCs) 的分化、活化1-3 ,但IFN -能否诱导

16、CML 骨髓单个核细胞生成DCs 尚未见报道,本研究将IFN -与GM- CSF 联合作用于CML 骨髓单个核细胞,观察其是否能诱导CML 骨髓单个核细胞成为 DCs 以及探讨诱导DCs 的功能。材料和方法1 材料1.1 主要试剂 rhIFN - 购于上海罗氏制药有限公司,原液浓度为 3109 U/L；rhGM- CSF、rhIL-4 和 rhTNF - 均购于Peprotech 公司。RPMI - 1640 培养基购于Gibco - BRL 公司,按说明书配制,4 保存；特级胎牛血清购于杭州四季青生物制品公司,使用前56水浴30 min 灭活补体后分装, - 20 保存。四甲基偶氮唑盐(MT

17、T) 购于Sigma 公司；DMSO 购于上海华美生物工程公司。CD80、CD86、CD83、CD1a 和HLA - DR 单抗购于Caltag 公司；CD3、CD19、CD45、CD14、CD33、CD16、CD56 单抗购于BD公司。AnnexinV FITC 细胞凋亡检测试剂盒购于美国Bender 公司。BCR/ ABL 探针购自美国 Vysis 公司。1.2 病人资料 初发慢性期 CML 病人 12 例,均为 Ph 染色体和 BCR/ABL 融合基因阳性。中位年龄43岁(21-59岁)。男性 10 例,女性 2 例。诊断和分期依据血液学诊断标准4。2 方法2.1 DCs 的体外培养 树

18、突状细胞的培养参考文献5, 略有变动。无菌采集CML患者骨髓 2mL, 肝素抗凝, 经淋巴细胞分离液梯度离心后,取界面层的单个核细胞(MNCs) ,用 NH4Cl 裂解液裂解红细胞,用无钙镁的 PBS 洗涤3 次,加入含10 %小牛血清的 RPMI-1640 培养液,调整细胞浓度为 2109 cells/ L ,加入6 孔板,每孔3 mL 。各孔分别加入 rhGM- CSF 1106 U/ L、rhIFN -2106 U/ L (IFN -组),rhGMCSF 1106 U/ L、rhIL-4 5105 U/ L(IL-4 组), rhGM-CSF 1106 U/L(单用 GM- CSF组)和

19、rhIFN- 2106 U/L (单用IFN-组)。置于37 、5% CO2 的培养箱中培养, 2d 后轻轻吸尽培养基全量换液以去除悬浮细胞,以后每 3d 半量换液 1 次并添加细胞因子,于第7 d 部分孔加入rhTNF-5104 U/L。第7、10 d 各收集微贴壁及悬浮细胞 1 次。用倒置显微镜进行形态学观察并摄片,采用台盼蓝拒染试验进行细胞计数,每组3 个复孔。2.2 光镜下DCs 形态学观察 收集培养后的细胞悬液离心富集后涂片自然干燥,进行瑞氏染色镜检,摄片。2.3 DCs 免疫表型检测DCs 细胞悬液用PBS 洗涤2 次,调整细胞浓度5108 cells/ L ,加入流式细胞仪(FC

20、M) 专用分析试管中,每管100L ,再分别加入鼠抗人单抗 CD80、CD83、CD3、CD14/ FITC、CD86、CD1a 、HLA - DR、CD19、CD33/ PE ,4 标记30 min ,同时设同型对照,洗涤后用流式细胞仪检测细胞免疫标记水平, FACSCalibur (Becton Dickinson) 流式细胞仪检测,CellQuest 软件分析。2.4 磷脂酰丝氨酸(PS) 转位检测参照Annexin V 细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。于第10 d ,收集1106 个细胞,冷PBS 洗涤 2 次, 1 000 r/ min 离心,4 7 min ,弃上清。将细胞重悬于1

21、mL 1binding buffer ,取100L 细胞置于流式细胞仪专用试管中,加5L AnnexinV FITC 和5L PI ,轻轻混匀,避光室温反应15 min ,加入300L 1binding buffer ,立即用流式细胞仪检测,CellQuest 软件分析结果。2.5 荧光原位杂交法(FISH) 标本在72的变性液中变性后采用 BCR 和 ABL 基因序列特异性探针进行间期荧光原位杂交,杂交后严格洗涤,用含DAPI的复染液复染标本,置荧光显微镜(Olympus BX - 60)下观察。2.6 混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction ,MLR) 为初步

22、了解IFN - 联合GM - CSF 诱生的DCs 刺激淋巴细胞增殖的功能,我们收集第 7、10 d 的细胞进行同种异体混合淋巴细胞反应,采用MTT法。简言之,培养后的细胞用丝裂霉素(50 mg/L) 处理1 h 后作为刺激细胞,以不同比例(DCT 细胞为1100、110和11) 与1108 cells/L 的T 细胞(健康献血员的外周血经尼龙毛柱孵育而得) 在96 孔U 型板中作用92 h ,总体积为每孔200L,每个浓度均作3个平行孔。然后加入MTT(5g/L)10L ,4h 后吸弃悬液加入DMSO,用酶标仪检测波长为570 nm 时的吸光度(A) 值,结果取均值。以IL-4 组作为对照组

23、,该组细胞以同样比例与 T 细胞混合培养。3 统计学处理采用SPSS 11.0 软件分析。计量资料实验数据以均数标准差(xs) 表示。单变量配对资料之间的比较采用配对样本t 检验。结果1 DCs 形态学检测结果培养2-3d 后,倒置显微镜下即可观察到细胞由均匀悬浮状态变为大量成簇生长。随着培养时间的延长,形态由圆形变为不规则形,细胞周围开始出现细小的树突样伪足。培养 7d 后IFN -组及IL -4 组均显示出典型的 DCs 形态(图1) ,两者形态无明显差异。单用GM- CSF 组大多数呈现圆形无突起的粒细胞样细胞及牢固贴壁巨噬细胞样细胞；单用IFN -组大多数为体积小、无突起的粒细胞样细胞

24、。2 DCs 免疫表型比较培养7 d 后, IFN-组与IL- 4 组均有CD80、CD86、CD1a ,HLA-DR 和CD83 一定量的表达(以百分率表示),IFN-组免疫标记CD80、CD86、CD83、HLA - DR 的表达显著高于IL-4 组(P 0.05) (图2)。经TNF-刺激后, IFN-组与IL - 4 组DCs CD80、CD86、CD83、HLA-DR 的表达进一步上调, IFN-组免疫标记的表达高于IL-4 组, 两者差异显著(P0.05，n = 5)。加入TNF- 3 d 后,IFN 组的DCs 数量减少明显。为探明DCs 减少的原因,我们用AnnexinV FI

25、TC/PI 双标记进行DCs 的凋亡检测,发现经TNF-刺激 3 d 后, IFN 组DCs 凋亡高于 IL-4 组。前者AnnexinV - FITC 阳性率水平为(46.335.50)% , 后者为(23.673.52)% ,两者差异显著(P0.05 , n = 3)。4 荧光原位杂交( FISH)1 例 CML 诱导后的细胞进行FISH 检测, IFN-组 BCR/ABL 融合基因阳性率为91% ,IL-4 组融合基因阳性率为84 %(见图5)。证实两组DCs 均有来源于白血病克隆的细胞。5 DCs 的免疫刺激功能TNF-刺激前后,随着 DCs 与 T 细胞比例的上升,IFN-组与 IL

26、-4 组DCs 刺激T 淋巴细胞增殖的能力增强。TNF -刺激前, IFN - 组刺激T 淋巴细胞增殖的能力较IL-4 组强,其中DCT为11组差异显著(P0.05 , n = 3) (图6)；经TNF-刺激后,两组DCs 刺激T 淋巴细胞增殖能力进一步增强, IFN-组刺激T 淋巴细胞增殖的能力显著强于IL- 4组, 其中DCT为110与11 ,两组差异显著(P0.05,n = 3) (图7)。讨论树突状细胞(DCs) 是体内功能最强的抗原递呈细胞(APC)6-8 ,在激发以抗原特异性细胞毒性 T 细胞过继性治疗肿瘤中起重要作用。体外,DCs 通常由外周血的CD14+ 细胞9 或CD34+

27、细胞10 经适宜的细胞因子诱导而来。CML外周血主要为粒细胞,CD14+ 细胞甚少,且CD14+ 细胞无扩增能力9,10。因此,从CML患者外周血中得到足够量的CD14+ 细胞进行DCs 扩增用于临床治疗受到限制。CML患者骨髓中含有肿瘤克隆细胞,具有扩增能力,如果能将此部分白血病细胞诱导分化产生DCs ,由于其前体为肿瘤细胞,故必然带有肿瘤抗原,加之本身又是功能强大的APC ,高表达共刺激分子,刺激 CTL 增殖,发挥特异性的自体抗白血病效应,这样就为我们提供了一条前景乐观的特异性抗白血病治疗途径。我们前期的研究联合应用GM-CSF、IL-4 和 TNF-已成功地将CML的骨髓单个核细胞诱导

28、分化成为DCs ,并且表明CML来源的DCs 刺激同种异体 T 淋巴细胞增殖的能力较正常人来源的 DCs 低11 。IFN-是治疗慢性髓性白血病的一线药物之一, 能使10%-20%的慢性期CML患者达主要的细胞遗传学缓解(Ph 阳性细胞比例35 %) ,这些病人将获得较长的生存期12 。此外有报道, IFN-治疗CML 的临床反应与存在的CML-特异性 T 细胞呈高度相关性13。我们设想,IFN-可能通过调节CML来源 DCs 的分化、活化而间接地发挥治疗作用。本研究以IFN - 2106 U/L 联合GM-CSF 作用于CML骨髓单个核细胞,结果诱导出与IL-4 组形态相似、数量相当的DCs

29、 ,而单用GM-CSF组及单用IFN-组无明显树突状细胞形成。这与 Paquette 等2 通过骨髓活检的发现:对IFN-治疗有反应的CML 患者, 其骨髓中DCs 数量较治疗前显著增加一致。进一步用 FCM 免疫表型分析表明,培养 7d 后IFN-组 DCs CD80、CD86、CD83、CD1a、HLA-DR 都具有较高水平的表达,且与IL-4 组比较, CD80、CD86、CD83、HLA-DR 的表达有显著提高；加用TNF-后,得到类似的结果。表明IFN-可以促进CML 骨髓单个核细胞来源的DCs 的分化及成熟。此外,研究发现经 TNF-刺激后, IFN-组 DCs 免疫标记上调的同时

30、,活细胞数量有减少。我们用AnnexinV - FITC/ PI 双染色凋亡检测发现, IFN-组 DCs 经TNF-刺激后凋亡增加,这可能与DCs 充分活化后启动了死亡调节机制以维持免疫自稳状态有关,其确切机制有待于进一步研究。结合FISH 检测结果,表明诱导的DCs 来源于 CML 克隆,与IL-4 组比较,IFN -组BCR/ ABL 融合基因阳性率没有下降趋势,这与各家的报道有符合2,3及不符14之处,可能与实验方法的差异有关。在此基础上,我们鉴定了诱导的DCs 的刺激淋巴细胞增殖的能力, 发现TNF-刺激前后,IFN-组 DCs 对同种异体T 细胞的激发功能均强于IL-4 组,表明G

31、M-CSF联合IFN-诱导的CML-DCs 具有较强的抗原递呈功能。由于IFN-与GM-CSF 均是临床常用的药物,而本研究发现两种药物体外联合作用可将CML骨髓单个核细胞诱导成为较成熟的、具有抗原递呈能力的DCs ,这对于临床治疗白血病将起到指导作用。参考文献1 Thomas Luft , Ken C Pang , Elisabeth Thomas , et al. Type I IFNs enhance the terminal differentiation of dendritic cellsJ. J Immunol , 1998 , 161(4): 1947-1953.2 Paque

32、tte RL , Hsu N , Said J , et al. Interferon - alpha induces dendritic cell differentiation of CML mononuclear cells in vitro and in vivo J . Leukemia , 2002 , 16 (8) : 1484-1489.3 Lucia G, Paola B , Carmela R , et al. IFN-alpha promotes the rapid differentiation of monocytes from patients with chron

33、ic myeloid leukemia into activated dendritic cells turned to under go full maturation after LPS treatmentJ . Blood, 2004 , 103(3): 980 - 987.4 陆道培,童春容. 慢性髓性白血病A. 见:张之南,沈悌主编. 血液病诊断及疗效标准M. 第2版. 北京: 科学技术版社, 1998. 218-228.5 Bai L , Feuerer M, Beckhove P , et al. Generation of dendritic cells from human

34、bone marrow mononuclear cells : Advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cellsJ. Int J Oncol , 2002 , 20(2): 247-253.6 黄竞荷,向军俭,杨红宇. 抗肿瘤树突状细胞疫苗研究进展J. 中国病理生理杂志, 2001, 17(2) : 165-169.7 沈媛,曾耀英,肇静娴,等. 雌二醇对人树突状细胞成熟和功能的影响J . 中国病理生理杂志, 2005 , 21(3):455-458.8 张浩

35、,郑树森,蒋国平,等. 淋巴细胞趋化因子增强肝癌树突状细胞融合瘤苗体外免疫作用J. 中国病理生理杂志, 2005 , 21(4): 727-732.9 Pickl WF, Majdic O, Kohl P, et al. Molecular and functional characteristics of dendritic cells generated from highly purified CD14+ peripheral blood monocytes J. J Immunol , 1996 ,157 (9): 3850-3859.10 Cella M, Sallusto F ,

36、Lanzavecchia A , et al. Origin , maturation and antigen presenting function of dendritic cellsJ . Curr Opin Immunol, 1997, 9(1): 10-16.11 童向民,金洁,薛永权,等. 慢性粒细胞白血病来源的树突状细胞生物学特性的研究J . 浙江大学学报(医学版), 2005 , 34(4) : 348-352.12 Garcia-Manero G, Talpaz M, Kantarjian HM. Current therapy of chronic myelogenous leukemia J. Intern Med , 2002 ,41(4): 254- 264.13 Molldrem