生化检验技术基础

1、生化检验技术基础 与进展 一、比色分析 1 1比色分析理论比色分析理论Beer-Lambert Beer-Lambert 定律定律 A = lgA = lg（I I0 0/I/I）KCL KCL 或或 I II I0 01010-KCL -KCL I I0 0：入射光强度：入射光强度 I I：透过光强度：透过光强度 K K：常数：常数 C C：溶液浓度：溶液浓度 L L：溶液的厚度：溶液的厚度 （1 1）郎伯定律）郎伯定律 I0 It l L -dIIdl， -dIaIdl， dI/I=-adl 积分 It L dI/I -a dl 得： ln(I0 / It)-aL I0 0 将ln改为lg

2、，则为：lg（ I0 / It）-0.434aLKL 令lg（ I0 / It） A，则A KL （2 2）比尔定律）比尔定律 A AK K”C C （3 3）郎伯）郎伯- -比尔定律比尔定律 A AKLCKLC 透光率（透光率（transmittancetransmittance，T T，透射率），透射率） T TI / II / I0 0 吸光度（吸光度（absorbanceabsorbance，A A） 光密度（光密度（eptical densityeptical density，D D或或ODOD） A Alg Ilg I0 0/I/I-lgT-lgT T T1010-A -A 101

3、0-KCL -KCL A A KCLKCL 当当L L用用cmcm，C C用用mol/Lmol/L表示，则表示，则K K即称之为摩即称之为摩 尔吸光系数，用尔吸光系数，用表示。表示。 当当C C1mol/L1mol/L，L L1cm1cm，则，则A A。 T T与与A A的关系的关系 透光率（透光率（T） 吸光度（吸光度（A） 1 0.000 0.75 0.125 0.5 0.301 0.25 0.602 0.17 0.770 0.1 1.000 0.05 1.301 0.01 2.000 0.001 3.000 2 2影响因素影响因素 （1 1）化学因素的影响）化学因素的影响 溶液中溶质可因

4、浓度的改变而发生溶液中溶质可因浓度的改变而发生 离解、缔合，与溶剂间的作用等原因而离解、缔合，与溶剂间的作用等原因而 出现偏离比尔定律的现象。由化学因素出现偏离比尔定律的现象。由化学因素 引起的偏离，有时可控制溶液条件设法引起的偏离，有时可控制溶液条件设法 减免。此外，能产生荧光的物质也可导减免。此外，能产生荧光的物质也可导 致偏离比尔定律。致偏离比尔定律。 （2 2）非单色光的影响）非单色光的影响 比尔定律的一个重要条件是单色光，比尔定律的一个重要条件是单色光， 但在比色分析中常有不同波长的光同时但在比色分析中常有不同波长的光同时 存在。这就使吸光度发生改变，从而偏存在。这就使吸光度发生改变

5、，从而偏 离比尔定律。离比尔定律。 波长的选择 可见 绿色带黄 深黄 桔红 深红 深紫 青紫 紫蓝 蓝色带绿 绿色带蓝 深绿 Ultra-violet紫外200400 深紫 深红 桔红 深黄 绿色带黄 暗绿 绿色带蓝 蓝色带绿 紫蓝 青紫 被测溶液颜色颜色 750800 610750 595610 560580 580595 500560 490500 480490 435480 400435 波长(nm) （3 3）光学因素的影响）光学因素的影响 散射是向空间各个方向，而使透射散射是向空间各个方向，而使透射 光减弱。反射可使光能损失，当光线通光减弱。反射可使光能损失，当光线通 过两种不同介质

6、时，则发生反射。当样过两种不同介质时，则发生反射。当样 本溶液与空白溶液的折射率有较大差异本溶液与空白溶液的折射率有较大差异 时，导致吸收值的偏差。时，导致吸收值的偏差。 （4 4）非平行光通过吸收池时，由于光线的）非平行光通过吸收池时，由于光线的 倾斜使厚度倾斜使厚度L L增大而影响测量值。增大而影响测量值。 3 3比色法的误差比色法的误差 （1 1）仪器误差）仪器误差 滤光片，狭缝过宽，光电池疲劳，滤光片，狭缝过宽，光电池疲劳， 仪器结构，散热不良。仪器结构，散热不良。 （2 2）方法误差）方法误差 （3 3）操作误差）操作误差 比色法举例 1. 1. 总蛋白总蛋白(TP)(TP) 蛋白质

7、中的肽键+Cu 2+ 碱性条件 紫红色络合物 引起在波长540560nm范围内吸光度的上升, 与 总蛋白含量成正比 2. 2. 白蛋白白蛋白(ALB)(ALB) 白蛋白+溴甲酚绿 pH4.2 白蛋白溴甲酚绿复合物 引起在波长630nm范围内吸光度的上升, 与白蛋 白含量成正比 二、分光光度计 1 1光源光源 热光源热光源: : 钨灯、卤钨灯（钨灯、卤钨灯（3203202500nm2500nm） 气体放电光源：气体放电光源： 氢灯、氘灯（氢灯、氘灯（185185375nm375nm）。）。 氘灯发光强度比氢灯强氘灯发光强度比氢灯强3 35 5倍，是目前倍，是目前 紫外光区常用光源。紫外光区常用光

8、源。 2. 2. 单色器单色器 单色器是一种用来把光源发出的复合光单色器是一种用来把光源发出的复合光 分解成单色光，并能任意改变所需波长的装分解成单色光，并能任意改变所需波长的装 置。置。 (1)(1)棱镜棱镜 玻璃棱镜的折射率大、色散能力也大，玻璃棱镜的折射率大、色散能力也大， 因而分辨本领高。但它吸收紫外光，因此只因而分辨本领高。但它吸收紫外光，因此只 适用于适用于3503503000nm3000nm的波长范围。的波长范围。 石英棱镜对紫外光吸收少，适用于石英棱镜对紫外光吸收少，适用于195-195- 4000nm4000nm间分光。但由于石英棱镜折射率低于间分光。但由于石英棱镜折射率低于

9、 玻璃，因而色散能力差。玻璃，因而色散能力差。 (2)(2)光栅光栅 光栅是利用光的衍射、干涉原理制成的光栅是利用光的衍射、干涉原理制成的 色散元件。目前，全息光栅在质量上，成本色散元件。目前，全息光栅在质量上，成本 上都大大优于机械光栅。因光栅分光在紫外上都大大优于机械光栅。因光栅分光在紫外 和可见光区均适用，且色散力强、分辨率高，和可见光区均适用，且色散力强、分辨率高， 故近年生产的分光光度计大都采用光栅作单故近年生产的分光光度计大都采用光栅作单 色器。色器。 3 3比色杯比色杯 比色杯可由玻璃和石英等材料制成，比色杯可由玻璃和石英等材料制成， 玻璃适用于玻璃适用于350nm350nm以上

10、光区，而石英杯以上光区，而石英杯 则适用于紫外和可见光区。则适用于紫外和可见光区。 4 4检测器检测器 在分光光度计中，把光信号转在分光光度计中，把光信号转 变成电信号输出的装置称检测器。变成电信号输出的装置称检测器。 光电池光电池 光电管光电管 光电倍增管光电倍增管 双波长分光光度计 来自光源的光被两个单色器分别分离出来自光源的光被两个单色器分别分离出 波长为波长为1 1和和2 2的两束单色光。经过折波的两束单色光。经过折波 器后，两束波长不同的单色光交替地照射器后，两束波长不同的单色光交替地照射 于同一样品杯。样品杯背后的光电倍增管于同一样品杯。样品杯背后的光电倍增管 交替地接收到两种波长

11、照射吸收池后所产交替地接收到两种波长照射吸收池后所产 生的信号。此信号经电子电路转化为两个生的信号。此信号经电子电路转化为两个 吸光度之差吸光度之差A A。 三、酶法分析 酶法分析包括两方面的内容：酶法分析包括两方面的内容： 借助酶来测定某一化合物的浓度，借助酶来测定某一化合物的浓度， 如测定体液中的葡萄糖、甘油三酯、胆如测定体液中的葡萄糖、甘油三酯、胆 固醇、尿素、尿酸、肌酐等。固醇、尿素、尿酸、肌酐等。 借助酶来测定另一种酶的活性，借助酶来测定另一种酶的活性， 实际上是用酶来测定待测酶的产物，如实际上是用酶来测定待测酶的产物，如 转氨酶、肌酸激酶、淀粉酶等。转氨酶、肌酸激酶、淀粉酶等。 葡

12、萄糖葡萄糖 葡萄糖O2H2O 葡萄糖氧化酶 葡萄糖酸H2O2 H2O2苯酚4-氨基安替比林 过氧化物酶 醌亚胺H2O 尿素尿素 尿素H2O 脲酶 2NH4+CO2 NH4+-酮戊二酸NADH 谷氨酸脱氢酶 谷氨酸NAD+H2O 肌酸激酶（肌酸激酶（CK） 磷酸肌酸ADP CK 肌酸ATP 葡萄糖ATP HK 葡萄糖-6-磷酸ADP 葡萄糖-6-磷酸NADP G6PDH 6-磷酸葡萄糖酸NADPHH+ 丙氨酸氨基转移酶（丙氨酸氨基转移酶（ALTALT） 丙氨酸-酮戊二酸 ALT 丙酮酸谷氨酸 丙酮酸NADHH+ LDH 乳酸NAD+H2O 酶催化特点 高度的特异性 高催化效率 作用条件温和 酶的

13、活性部位 底物结合部位 催化部位 酶的辅助因子 金属离子 辅基和辅酶 NAD ，NADP 酶的分类 1. 氧化还原酶 2. 转移酶 3. 水解酶 4. 裂合酶 5. 异构酶 6. 合成酶 酶的系统命名 应将酶的一种或两种底物以及催 化反应的性质明确标明。 乳酸脱氢酶 L-乳酸：NAD+氧化还原酶 肌酸激酶 ATP：肌酸磷酸转移酶 酶的活性单位 一国际单位为在一分钟内催化转变1 个微摩尔的反应物的酶量. IUU U/L 1Katal为每秒钟转化1mole底物的酶 量 1国际单位=16.67nKatal 1Katal=6107国际单位 酶活性测定 影响酶活性测定：底物、激活剂、 抑制剂、缓冲液、p

14、H、温度、酶浓 度。 在最适条件下以求达到最大的反应 速度。 但由于底物的溶解度低，或售价太 高，或需连锁的酶反应，则必须对 测定条件作修正。 酶活性测定的最适条件 合适的底物、辅因子、活化剂、变构剂合适的底物、辅因子、活化剂、变构剂 的种类和浓度的种类和浓度 指示酶和辅助酶的种类和浓度指示酶和辅助酶的种类和浓度 反应混合液的最适反应混合液的最适pHpH，缓冲液种类和，缓冲液种类和 浓度浓度 去除各种抑制剂去除各种抑制剂 酶促反应的两个阶段 反应级数 0级 1级 P 1.可逆反应可逆反应 2.产物抑制产物抑制 3.酶变性失活酶变性失活 v=dP/dt 4.底物不饱和底物不饱和 S 时间 t 酶

15、反应进程和酶浓度曲线 酶量E 40 1.E越大，线性反 产 应期越短 物 2.E相同，S越小， P 20 线性反应期越短 10 5 0 5 10 15 20 时间(min) 酶反应时间曲线 时间(min) 5(t0) 反应时间越短， 10(t1) 线性范围越大 15(t2) 20(t3) 0 10 20 30 40 酶量E 米氏方程 E + SESE + P k kk k +1 +2 -2 -1 v= VS Km+S v V 2 S Km 米氏曲线 S V Vmax Km Vmax 2 KmKm 米氏常数米氏常数 米米- -孟氏公式：孟氏公式：v vVmS/(KmVmS/(Km S)S) 当当

16、SKmSKmSKm时，则时，则v vVmVm，即反应，即反应 速度是一个常数，为零级反应。速度是一个常数，为零级反应。 如如SSKmKm时，混合级反应时，混合级反应。 米氏常数的意义 如如v v0.5Vm0.5Vm，则，则KmKmSS，KmKm值等于酶促反值等于酶促反 应的初速度为最大速度的一半时所需的底应的初速度为最大速度的一半时所需的底 物浓度。物浓度。 KmKm等于等于ESES的解离常数；而的解离常数；而KmKm的倒数可代表的倒数可代表 酶和底物的亲和力。酶和底物的亲和力。 KmKm是酶的特征性常数，当是酶的特征性常数，当pHpH、温度和离子、温度和离子 强度恒定时，强度恒定时，KmKm

17、只和酶及底物的性质有关，只和酶及底物的性质有关， 而与酶浓度无关。而与酶浓度无关。 纯度不同的同一种酶，如杂质中没有可使纯度不同的同一种酶，如杂质中没有可使 底物发生旁反应的其它酶或酶的激活剂和底物发生旁反应的其它酶或酶的激活剂和 抑制剂，则抑制剂，则KmKm的变化不大。的变化不大。 米氏常数的应用 （1 1）如已知酶的）如已知酶的KmKm，可计算某一底，可计算某一底 物浓度时的物浓度时的v/Vmv/Vm。 （2 2）如要求）如要求v v占占VmVm一定的百分比，也一定的百分比，也 可算出所需底物浓度为其可算出所需底物浓度为其KmKm的多少的多少 倍。倍。 （3 3）利用工具酶来测定某一底物的

18、）利用工具酶来测定某一底物的 浓度时，可计算工具酶的用量。浓度时，可计算工具酶的用量。 （4 4）测定几个同工酶对同一底物的）测定几个同工酶对同一底物的 KmKm，可估计是原级（，可估计是原级（ KmKm常有差异）常有差异） 还是次生性同工酶（还是次生性同工酶（ KmKm接近或相接近或相 同）。同）。 （5 5）测定正逆方向底物的）测定正逆方向底物的KmKm，可大，可大 体知道该酶催化哪一方向为主。体知道该酶催化哪一方向为主。 （6 6）如已知一组酶中各酶的）如已知一组酶中各酶的KmKm及其及其 相应底物的浓度，有助于寻找限速相应底物的浓度，有助于寻找限速 步骤。步骤。 Km的求取 Linew

19、eaver-Burk作图法作图法 1/v(Km/Vm)(1/S)1/Vm Eadie-Hofstee作图法作图法 vVmKm(v/S) Eisenthal和和Cornish-Bowden作图法作图法 设设Y轴和轴和X轴分别为求取轴分别为求取Vm及及Km的座的座 标，将不同标，将不同S浓度点在浓度点在X轴的负侧；相应的轴的负侧；相应的 反应速度点在反应速度点在Y轴上，连接各线，交点在轴上，连接各线，交点在Y 轴上的座标为轴上的座标为Vm，在在X轴上的座标为轴上的座标为Km。 酶活性测定的基本知识 酶活性是通过测定酶促反应过程中酶活性是通过测定酶促反应过程中 单位时间内底物的减少量或产物的生单位时

20、间内底物的减少量或产物的生 成量，即测定酶促反应的速率来获得成量，即测定酶促反应的速率来获得 的。的。 （1 1）定时法）定时法 测定酶反应开始后某一时间内（测定酶反应开始后某一时间内（t t1 1到到t t2 2） 产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初 速度的方法称为定时法。速度的方法称为定时法。 产产 2 2 物物 3 3 生生 1 1 成成 t t1 1 t t2 2 （2 2）连续监测法）连续监测法 连续测定（每连续测定（每15s15s1min1min监测一次）监测一次） 酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度

21、随时间的变化来求出酶反应初速度的方法随时间的变化来求出酶反应初速度的方法 称为连续监测法，又称动力学法或速率法。称为连续监测法，又称动力学法或速率法。 这种方法的优点是可将多点的测定结果连这种方法的优点是可将多点的测定结果连 接成线，很易找到成直线的区段，来计算接成线，很易找到成直线的区段，来计算 酶活性。此法较为准确。酶活性。此法较为准确。 分为直接连续监测法和间接连续监测法。分为直接连续监测法和间接连续监测法。 法法. . 连续监测法的测定时间 吸 光 度 A3 A2 A1 t1 t2 t3 t4 时间 （3 3）平衡法）平衡法 通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底通过测定酶反应开始

22、至反应达到平衡时产物或底 物浓度总变化量来求出酶活性的方法称为平衡法。物浓度总变化量来求出酶活性的方法称为平衡法。 用平衡法测定时，因产物的增加或底物的减少与用平衡法测定时，因产物的增加或底物的减少与 反应时间不成线性，故不能把反应时间不成线性，故不能把PP或或SS的总变化量的总变化量 除以除以t t来代表每分钟产物或底物的变化。另外，平来代表每分钟产物或底物的变化。另外，平 衡法也会受到产物抑制、可逆反应等因素的影响，衡法也会受到产物抑制、可逆反应等因素的影响， 由于反应时间较定时法长，故这种影响会更大，由于反应时间较定时法长，故这种影响会更大， 测定结果也较连续监测法低。对于有些零级反应测

23、定结果也较连续监测法低。对于有些零级反应 期很短的酶促反应，用连续监测法和定时法很难期很短的酶促反应，用连续监测法和定时法很难 测出其初速度，也只得采用平衡法测定。测出其初速度，也只得采用平衡法测定。 定时法与连续法比较 定时法定时法 条件无限制条件无限制 试剂需量少，经济试剂需量少，经济 采用放射性试剂时，采用放射性试剂时， 灵敏度高灵敏度高 结果不能立刻揭晓结果不能立刻揭晓 人工操作多，费时人工操作多，费时 毋需偶联酶毋需偶联酶 产物会生抑制作用产物会生抑制作用 连续法连续法 因偶联酶使条件受限因偶联酶使条件受限 制制 需量较大需量较大 与放射性试剂来比，与放射性试剂来比， 灵敏度低灵敏度

24、低 结果立刻揭晓结果立刻揭晓 人工操作少人工操作少 偶联酶的费用很大偶联酶的费用很大 偶联作用能消耗产物偶联作用能消耗产物 （一）工具酶及酶偶联反应 通过酶偶联反应间接地测出第通过酶偶联反应间接地测出第 一个酶促反应中待测物的浓度或待一个酶促反应中待测物的浓度或待 测酶的活性。那些作为试剂用于测测酶的活性。那些作为试剂用于测 定化合物浓度或酶活性的酶称为工定化合物浓度或酶活性的酶称为工 具酶。具酶。 AB 酶1 CD C（或D）E 酶2 FG F（或G）H 酶3 IJ 酶1：待测酶 酶2：辅助酶 酶3：指示酶 E、H：辅助底物 在利用工具酶的反应中，唯一的限在利用工具酶的反应中，唯一的限 速因

25、子应该是待测化合物或待测酶。速因子应该是待测化合物或待测酶。 对工具酶试剂中的杂质（杂酶、抑对工具酶试剂中的杂质（杂酶、抑 制剂等）的含量也有一定的限制，制剂等）的含量也有一定的限制， 以减少或避免干扰测定的副反应。以减少或避免干扰测定的副反应。 如果工具酶制剂中污染了待测酶会对如果工具酶制剂中污染了待测酶会对 测定结果产生严重影响。测定结果产生严重影响。 如天冬氨酸转氨酶（如天冬氨酸转氨酶（ASTAST）测定的工具酶）测定的工具酶 是苹果酸脱氢酶（是苹果酸脱氢酶（MDHMDH），如污染），如污染0.03%0.03%的的 ASTAST，则当，则当ASTAST活性为活性为7U/L7U/L时，测定

26、误差为时，测定误差为 6%6%。 而测定丙氨酸转氨酶（而测定丙氨酸转氨酶（ALTALT）的工具酶是）的工具酶是 乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（LDHLDH），如污染），如污染0.03%0.03%的的ALTALT， 则当则当ALTALT活性为活性为5U/L5U/L时测定误差也是时测定误差也是6%6%。 （二）常用监测物质的特性 1 1NADHNADH或或NADPHNADPH： 乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（LDHLDH） NADNAD+ +或或NADPNADP+ + 苹果酸脱氢酶（苹果酸脱氢酶（MDHMDH） NADNAD+ +或或NADPNADP+ + 谷氨酸脱氢酶（谷氨酸脱氢酶（GLDHGLDH） NA

27、DNAD+ +或或NADPNADP+ + 6- 6-磷酸葡萄糖脱氢酶（磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDG6PD） 动物动物G6PD NADPG6PD NADP+ + 微生物微生物G6PD NADG6PD NAD+ + NADHNADH或或NADPHNADPH在在340nm340nm有特征性光吸有特征性光吸 收，而它们的氧化型收，而它们的氧化型NADNAD+ +或或NADPNADP+ +则则 没有这个吸收峰，没有这个吸收峰，340nm340nm波长处的吸波长处的吸 光度与光度与NADNAD（P P）H H的浓度成正比。的浓度成正比。 另外另外NADNAD（P P）H H有强烈的荧光，其激有强烈的荧光，

28、其激 发波长为发波长为340nm340nm，发射波长为，发射波长为460nm460nm。 max：340nm 肌酸激酶（肌酸激酶（CK） 磷酸肌酸ADP CK 肌酸ATP 葡萄糖ATP HK 葡萄糖-6-磷酸ADP 葡萄糖-6-磷酸NADP G6PDH 6-磷酸葡萄糖酸NADPHH+ 丙氨酸氨基转移酶（丙氨酸氨基转移酶（ALTALT） 丙氨酸-酮戊二酸 ALT 丙酮酸谷氨酸 丙酮酸NADHH+ LDH 乳酸NAD+H2O 2 2H H2 2O O2 2指示反应指示反应 葡萄糖氧化酶、尿酸酶、甘油氧化葡萄糖氧化酶、尿酸酶、甘油氧化 酶、胆固醇氧化酶：用于葡萄糖、酶、胆固醇氧化酶：用于葡萄糖、 尿

29、酸、甘油、胆固醇的测定，可使尿酸、甘油、胆固醇的测定，可使 相应底物被相应底物被O O2 2氧化成氧化成H H2 2O O2 2，H H2 2O O2 2可通可通 过下列指示反应来检测过下列指示反应来检测。 使单一的色素原显色。无色色素原过氧使单一的色素原显色。无色色素原过氧 化物酶（化物酶（PODPOD）存在下被）存在下被H H2 2O O2 2氧化后可生氧化后可生 成有色的色素。成有色的色素。 使成对的色素原显色。必须要两个色素使成对的色素原显色。必须要两个色素 原共同存在，再在指示酶原共同存在，再在指示酶PODPOD的催化下生成的催化下生成 色素。色素。 发光反应。发光反应。H H2 2

30、O O2 2也可用化学发光反应来也可用化学发光反应来 监测，它是凭借某些荧光前身物在氧化后，监测，它是凭借某些荧光前身物在氧化后， 处于激发状态的分子可发射光子，光子量和处于激发状态的分子可发射光子，光子量和 H H2 2O O2 2的浓度成正比。的浓度成正比。 葡萄糖葡萄糖 葡萄糖O2H2O 葡萄糖氧化酶 葡萄糖酸H2O2 H2O2苯酚4-氨基安替比林 过氧化物酶 醌亚胺H2O 甘油三酯甘油三酯 甘油三酯H2O 脂蛋白脂酶 甘油脂肪酸 甘油ATP 甘油激酶 -磷酸甘油ADP -磷酸甘油O2 甘油磷酸氧化酶 磷酸二羟丙酮H2O2 H2O2 +4-氨基安替比林+ESPAS 过氧化物酶 醌亚胺H2

31、O ESPAS:N-乙基-N-(3-磺丙基)-间-茴香胺 3 3硝基苯衍生物硝基苯衍生物 芳香酯酶、磷酸酯酶和硫酸酯酶：对芳香酯酶、磷酸酯酶和硫酸酯酶：对- -硝基酚硝基酚 和有机酸或无机酸形成的酯类和有机酸或无机酸形成的酯类 糖苷酶：对硝基酚和糖苷衍生物糖苷酶：对硝基酚和糖苷衍生物 -谷氨酰转肽酶、芳香酰胺酶和胰蛋白酶：谷氨酰转肽酶、芳香酰胺酶和胰蛋白酶： 对对- -硝基苯胺的氨基酰衍生物硝基苯胺的氨基酰衍生物 故硝基苯酚或硝基苯胺作为底物的结合型化故硝基苯酚或硝基苯胺作为底物的结合型化 合物均无色，而一旦水解或游离型产物在合物均无色，而一旦水解或游离型产物在pHpH 大于大于8 8的碱性条

32、件下能生成黄色的醌类离子型的碱性条件下能生成黄色的醌类离子型 化合物，在化合物，在400nm400nm410nm410nm有光吸收峰，其吸有光吸收峰，其吸 光度与浓度成正比。光度与浓度成正比。 max ：405nm 碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（ALPALP） 磷酸对硝基苯H2O ALP 磷酸盐对硝基苯酚 - -谷氨酰转移酶（谷氨酰转移酶（ -GT-GT） -谷氨酰对硝基苯胺双甘肽 -GT 谷氨酰基双甘肽对硝基苯胺 （三）酶法分析的类型 用工具酶测定体液中代谢物的浓用工具酶测定体液中代谢物的浓 度，一般可用两种不同的测定方法。度，一般可用两种不同的测定方法。 1 1代谢物浓度的酶法分析代谢物浓度的酶

33、法分析 （1 1）终点法）终点法 将待测底物与工具酶保温一定时间后，将待测底物与工具酶保温一定时间后， 全部转变成可监测的化合物，然后测定后者全部转变成可监测的化合物，然后测定后者 的总量来计算待测物的总量或浓度。的总量来计算待测物的总量或浓度。 尿素尿素H H2 2O O 尿素酶 尿素酶 COCO2 22NH2NH3 3 乙醇乙醇NADNAD+ + 醇脱氢酶 醇脱氢酶 乙醛乙醛NADHNADHH H+ + 反应常呈一级反应。反应常呈一级反应。 使待测底物完全转变所需的时间取决于使待测底物完全转变所需的时间取决于 加入的工具酶量。加入的工具酶量。 （2 2）动力学法）动力学法 待测物不必完全转

34、变成可监测的化待测物不必完全转变成可监测的化 合物，而是利用工具酶反应速率来定量合物，而是利用工具酶反应速率来定量 其浓度：其浓度： 一是利用零级反应，如待测物是某一是利用零级反应，如待测物是某 个工具酶的激活剂或抑制剂，其浓度可个工具酶的激活剂或抑制剂，其浓度可 决定该工具酶的反应速度，可采用此方决定该工具酶的反应速度，可采用此方 法。因测定时该工具酶本身及其底物都法。因测定时该工具酶本身及其底物都 是足量的，故反应为零级反应。是足量的，故反应为零级反应。 例：测定血清中肝素 AT 肝素 AT（AT为肝素与AT复合物） AT凝血酶 凝血酶-AT（无活性）残余凝血酶 甲苯磺酰-甘-脯-精-4N

35、A 凝血酶 甲苯磺酰-甘-脯-精4-硝基苯胺 二是利用一级反应，本法的基本要求二是利用一级反应，本法的基本要求 是作为某一工具酶底物的待测物的浓度是作为某一工具酶底物的待测物的浓度SS 必须远小于该工具酶的必须远小于该工具酶的KmKm。此时反应速度。此时反应速度 基本上与基本上与SS成正比，呈一级反应。成正比，呈一级反应。 动力学法较终点法具有简便、省时、动力学法较终点法具有简便、省时、 干扰少、可测定低浓度物质、不需样品对干扰少、可测定低浓度物质、不需样品对 照以及易于自动化等优点，成为自动化分照以及易于自动化等优点，成为自动化分 析的主要方法。但此法必须同时测定标准析的主要方法。但此法必须

36、同时测定标准 样品的反应速度，来推算未知样品中待测样品的反应速度，来推算未知样品中待测 物的浓度。物的浓度。 2 2酶活性测定的酶法分析酶活性测定的酶法分析 这类酶学分析法是用工具酶来测定待这类酶学分析法是用工具酶来测定待 测酶的产物以求取待测酶的活性，适合测酶的产物以求取待测酶的活性，适合 于待测酶产物不能直接监测的情况。于待测酶产物不能直接监测的情况。 也可有终点法和动力学法两种。也可有终点法和动力学法两种。 （1 1）终点法）终点法 将底物与待测酶反应一定时间后，将底物与待测酶反应一定时间后， 终止反应，再用指示酶测定该时间终止反应，再用指示酶测定该时间 内产物的生成量即可算出酶活性。内

37、产物的生成量即可算出酶活性。 （2）偶联反应的基本动力学 S Ex P1 Ei P2 应先将样品与工具酶预保温，使样品中的应先将样品与工具酶预保温，使样品中的 内源性干扰物充分催化消耗，然后加入底物内源性干扰物充分催化消耗，然后加入底物 S S起动反应。起动反应。 起动后，因起动后，因P P从零开始升高，故工具酶反应从零开始升高，故工具酶反应 速度也较低，不能代表待测酶反应速度，这速度也较低，不能代表待测酶反应速度，这 一时期称为延滞期。一时期称为延滞期。 随着反应进行，进入恒态期，只要工具酶随着反应进行，进入恒态期，只要工具酶 用量足够，就能正确地反映酶的活性用量足够，就能正确地反映酶的活性

38、. . A 延迟期 恒态期 非恒态期 1.5 1.0 S Ex P1 Ei P2 0.5 0 30 60 90 120 150 180 秒 （以NADH减少为指示反应） 如Ei用量过少，Ex的速度Vx大于Ei的速度，即P1生成的 速度大于P1消失的速度，可导致P1的逐渐堆积，不能成 为恒态或其延滞期极长。但如Ei用量足够，Vi等于或大 于Vx，则P1一旦生成可较快或很快转变成P2，P1产生与消 失速度一致而成为恒态。 （四）酶活性浓度的计算 Vt106 U/L（A/min） VsL A 吸光度变化吸光度变化 V Vt t为反应系统总体积为反应系统总体积 V Vs s为样品体积为样品体积 为被测

39、物的摩尔吸光系数为被测物的摩尔吸光系数(mol(mol-1 -1 cm cm-1 -1) ) L L为光径为光径 10106 6是将是将molmol转化成转化成molmol。 常数K值的意义和设置 Vt106 U/L（A/min） VsL （A/min）K Vt106 K VsL 常数K值的检验 ：pHpH；温度；单色光；仪器信号接收；温度；单色光；仪器信号接收 V V：仪器加样系统：仪器加样系统 对一些性质稳定的物质如对硝基酚、对硝基对一些性质稳定的物质如对硝基酚、对硝基 苯胺，可以用高纯试剂配成标准品，将它们苯胺，可以用高纯试剂配成标准品，将它们 作为标本进行酶的测定，根据其浓度和吸光作为

40、标本进行酶的测定，根据其浓度和吸光 度变化可计算出实际度变化可计算出实际K K值。值。 对对NAD(P)HNAD(P)H，可使用测葡萄糖试剂盒，对，可使用测葡萄糖试剂盒，对 已知浓度的葡萄糖标准品进行终点法测定，已知浓度的葡萄糖标准品进行终点法测定， 此法产生与葡萄糖相等摩尔数的此法产生与葡萄糖相等摩尔数的NAD(P)HNAD(P)H， 故不难从吸光度变化求出故不难从吸光度变化求出K K值。值。 利用标准管的方法较简单，但标准利用标准管的方法较简单，但标准 管的浓度必须在该比色法或紫外分光光管的浓度必须在该比色法或紫外分光光 度法测定的浓度线性范围内。标准曲线度法测定的浓度线性范围内。标准曲线

41、 法可得浓度和吸光度的线性范围，消除法可得浓度和吸光度的线性范围，消除 浓度过高偏离线性的影响，但标准曲线浓度过高偏离线性的影响，但标准曲线 的制备时间与测定样品的时间不同，容的制备时间与测定样品的时间不同，容 易产生试剂批号、配制、实验温度、仪易产生试剂批号、配制、实验温度、仪 器工作状态等因素造成的误差。器工作状态等因素造成的误差。 单试剂、双试剂、液体试剂 1. 1. 单试剂的优缺点单试剂的优缺点 优点：优点：操作简便适用于各类生化分析仪操作简便适用于各类生化分析仪 缺点：缺点：配方复杂（稳定剂、掩蔽剂），稳定性配方复杂（稳定剂、掩蔽剂），稳定性 差，不能完全避免内外源物质干扰。差，不能

42、完全避免内外源物质干扰。 2. 2. 双试剂的特点双试剂的特点 （1 1）可较彻底排除样品空白和内外源干扰物）可较彻底排除样品空白和内外源干扰物 （2 2）更加符合酶偶联反应的特性和过程）更加符合酶偶联反应的特性和过程 （3 3）试剂配方简单）试剂配方简单 （4 4）试剂稳定，便于储存，运输和使用）试剂稳定，便于储存，运输和使用 （5 5）可用抑制法直接测定某些同工酶）可用抑制法直接测定某些同工酶 3. 3. 液体试剂的优点液体试剂的优点 （1 1）不需手工调制，省工省时）不需手工调制，省工省时 （2 2）试剂批间差小，重复性好）试剂批间差小，重复性好 （3 3）杜绝干粉试剂重溶时因水质差引起

43、）杜绝干粉试剂重溶时因水质差引起 试剂变质试剂变质 （4 4）有利于急诊标本）有利于急诊标本 （5 5）按需取量，避免浪费）按需取量，避免浪费 自动生化分析仪主要参数 测定方法学类型的选择测定方法学类型的选择: : 终点法终点法, ,速率速率 法法, ,固定时间法固定时间法 温度温度 波长波长 样品与试剂量样品与试剂量 延迟时间延迟时间 测定时间测定时间 浓度校正因子浓度校正因子 四、免疫浊度分析法 抗体（抗体（AbAb）与可溶性抗原（）与可溶性抗原（AgAg）反应，）反应， 形成一定结构的免疫复合物，成为悬浮形成一定结构的免疫复合物，成为悬浮 于反应溶液中的微粒。在沉淀反应中形于反应溶液中的

44、微粒。在沉淀反应中形 成的复合物微粒具有特殊的光学性质，成的复合物微粒具有特殊的光学性质， 可用仪器检测，提高了方法的速度、灵可用仪器检测，提高了方法的速度、灵 敏度和易操作性。敏度和易操作性。 抗原-抗体沉淀反应的特征 1. 1. 抗体过剩区：抗体过剩区：随着抗原浓度增加，随着抗原浓度增加，ICIC 也相应增加，浊度增加。也相应增加，浊度增加。 2. 2. 等价点：等价点：抗原抗体相当时，所有抗体抗原抗体相当时，所有抗体 与抗原形成与抗原形成ICIC，浊度最大，达到等价点。，浊度最大，达到等价点。 3. 3. 抗原过剩区：抗原过剩区：抗原过量存在，不但不抗原过量存在，不但不 会形成更多的会形

45、成更多的ICIC，反而会引起原先的，反而会引起原先的ICIC 溶解，浊度下降，产生虚假的低浓度结溶解，浊度下降，产生虚假的低浓度结 果。果。 1 1透射比浊测定法透射比浊测定法 是测定入射光强度由于溶液中粒子的散射是测定入射光强度由于溶液中粒子的散射 而降低的程度，它并不直接测定散射的光强。而降低的程度，它并不直接测定散射的光强。 这一点与分光光度测定法极为类似。用这种这一点与分光光度测定法极为类似。用这种 方法时，多用聚乙二醇（方法时，多用聚乙二醇（PEGPEG）作为反应增）作为反应增 强剂。这种非离子型聚合物可以降低抗原抗强剂。这种非离子型聚合物可以降低抗原抗 体复合物的溶解度。体复合物的

46、溶解度。 2 2散射比浊测定法散射比浊测定法 它是直接测定溶液中微粒所散射的光强。它是直接测定溶液中微粒所散射的光强。 散射比浊法也已经用于自动分析仪器中。散射比浊法也已经用于自动分析仪器中。 3 3免疫浊度测定中应注意的问题免疫浊度测定中应注意的问题 （1 1）伪浊度的影响。）伪浊度的影响。 非特异的交叉反应非特异的交叉反应 增浊剂浓度增浊剂浓度 反应时间反应时间 样品本身的浊度样品本身的浊度 试剂的污染和变质试剂的污染和变质 器材不够清洁器材不够清洁 (2)(2)钩状效应（钩状效应（hook effecthook effect）的影响。当）的影响。当 AgAg和和AbAb浓度比例不当时，不

47、能有效浓度比例不当时，不能有效 地形成免疫复合物，产生弱阳性甚地形成免疫复合物，产生弱阳性甚 至假阴性结果。至假阴性结果。 (3)(3)严格的室内质控是极必要的。严格的室内质控是极必要的。 (4)(4)标准曲线的制作标准曲线的制作. . 五、方法学评价 （一）准确度试验 准确度是指测定值与准确度是指测定值与“真值真值”的符合程的符合程 度。是评价一项实验方法是否可取的重度。是评价一项实验方法是否可取的重 要指标。要指标。 1 1标准物鉴定标准物鉴定 为了确定和评价方法的准确性，常用基为了确定和评价方法的准确性，常用基 准标准液或参考血清为样本进行检测，准标准液或参考血清为样本进行检测， 所得结

48、果经统计学处理，以衡量方法的所得结果经统计学处理，以衡量方法的 准确性。准确性。 2 2回收试验回收试验 回收率的计算是（回收值回收率的计算是（回收值/ /加入值）加入值） 100100，这里的回收值是指标本中，这里的回收值是指标本中 加入标准液后的测定值减去标本原加入标准液后的测定值减去标本原 来的测定值。回收率达到来的测定值。回收率达到1001005 5 者为准确性符合要求的方法。者为准确性符合要求的方法。 回收试验应注意：回收试验应注意： 样品的选用样品的选用 样品最好应用新鲜混合血清。样品最好应用新鲜混合血清。 标准物的加入标准物的加入 应先配制成适当浓度的标准应先配制成适当浓度的标准

49、 物溶液，再加入到基础样品中。所加标准溶液物溶液，再加入到基础样品中。所加标准溶液 量越少越好。量越少越好。 标准物的加入浓度标准物的加入浓度 最好同时设计几个加入最好同时设计几个加入 不同浓度标准液的试验样品。加入标准液后的不同浓度标准液的试验样品。加入标准液后的 试验样品的总浓度不能超过本方法的线性范围。试验样品的总浓度不能超过本方法的线性范围。 操作准确操作准确 标准液的加入量必须准确无误，标准液的加入量必须准确无误， 应经多次试验。应经多次试验。 （二）精密度试验 目前常以重复性试验来衡量一个方法的精密度。目前常以重复性试验来衡量一个方法的精密度。 一般来说，标准差、变异系数（一般来说

50、，标准差、变异系数（CVCVs/xs/x100100） 小的实验方法精密。小的实验方法精密。 1 1批内精密度试验批内精密度试验 取一份样品，用欲测项目实取一份样品，用欲测项目实 验方法进行操作，反复测定验方法进行操作，反复测定2020次以上，计算每一次以上，计算每一 次的测定结果，然后计算次的测定结果，然后计算x x、s s、CVCV。 2 2批间精密度试验批间精密度试验 这种试验也是同一份标本进这种试验也是同一份标本进 行重复测定，至少为行重复测定，至少为2020次。但是重复测定不是在次。但是重复测定不是在 一天内完成，而是每天随患者标本一起测定，再一天内完成，而是每天随患者标本一起测定，

51、再 计算计算x x、s s、CVCV。 （三）灵敏度试验 灵敏度是单位浓度变化所引起的指示物灵敏度是单位浓度变化所引起的指示物 理量的变化。在定量分析中是指被检测理量的变化。在定量分析中是指被检测 物单位浓度的变化所引起的物理量的变物单位浓度的变化所引起的物理量的变 化。化。 所选用的方法，应进行线性试验，选用所选用的方法，应进行线性试验，选用 线性范围宽度适宜的方法。线性检验所线性范围宽度适宜的方法。线性检验所 得结果，可用回归方程（得结果，可用回归方程（Y Ya abXbX）处）处 理，回归系数（理，回归系数（b b）为灵敏度大小的指标，）为灵敏度大小的指标， 回归系数大，灵敏度高，反之亦

52、然。不回归系数大，灵敏度高，反之亦然。不 同方法也可用回归系数进行比较，回归同方法也可用回归系数进行比较，回归 系数大的灵敏度高。系数大的灵敏度高。 （四）线性试验 线性试验是衡量一个方法的检测范围的一种线性试验是衡量一个方法的检测范围的一种 实验。通过线性试验，可以了解该方法的最实验。通过线性试验，可以了解该方法的最 高检测值和最低检测值。高检测值和最低检测值。 超出上下限值的结果是不可靠的，为使结果超出上下限值的结果是不可靠的，为使结果 可靠，遇到这种情况应加大样品用量或稀释可靠，遇到这种情况应加大样品用量或稀释 样品后再次检测。样品后再次检测。 线性试验的方法基本同标准曲线的制备。一线性试验的方法基本同标准曲线的制备。一 般先进行线性试验，然后在线性范围内制备般先进行线性试验，然后在线性范围内制备 标准曲线。标准曲线。 （五）特异性及干扰试验 干扰是指标本中存在分析物以外的其他物质，干扰是指标本中存在分析物以外的其他物质， 致使测定结果有误差。致使测定结果有误差。 首先确定被试的可疑干扰物是否会引起误差，首先确定被试的可疑干扰物是否会引起误差， 再进一步分析