高效液相色谱法测定保加利亚乳杆菌胞内Acetyl_CoA

1、高效液相色谱法（HPLC测定保加利亚乳杆菌胞内Acetyl-CoA 摘要：建立了一种快速测定保加利亚乳杆菌胞内Acetyl-CoA含量的HPLC分析方法。以C 18（ Hypersil ODS2 5卩m色谱柱为固定相，以缓冲液A （ 0.2mol/L磷酸钠，pH=5和缓冲 液B （800mL 0.25mol/L磷酸钠，pH=5和200mL乙腈的混合物）为流动相，梯度洗脱，流速 为1mL/min，柱温25C,采用紫外检测器（254nm）进行检测。结果表明：该方法可以在17min 内实现Acetyl-CoA 与其他物质完全分离和定量，Acetyl-CoA 在0.0110.359卩mol/mL范围

2、内的线性关系良好，回归方程线性相关系数R2=0.9995，检出限（以信噪比（S/N）为3计） 为0.28mg/L，定量限（以 S/N为10计）为0.32mg/L。该方法用于保加利亚乳杆菌胞内 Acetyl-CoA含量的测定，相对标准偏差（n=6）为0.75%，重现性良好，三个水平的加标回收 率为 94.8%103.3%，该方法适用于保加利亚乳杆菌胞内Acetyl-CoA 快速、高效分离和定量。 关键词：高效液相色谱，保加利亚乳杆菌， Acetyl-CoA Determination of intracellular Acetyl-CoA in L.bulgaricus by HPLC HPLC

3、 ) method for the Abstract ： A high performance liquid chromatographic determination of Acetyl -CoA in Lactobacillus bulgaricus was developed . The stationary phase used were C 18 (Hypersil ODS2 5 卩 m ) chromatographic column and the two mobile-phase solvents used were buffer A( 0.2mol/L sodium phos

4、phate ， pH5) and buffer B(800mL of 0.25mol/L sodium phosphate mixed with 200mL pH5 of acetonitrile )， gradient elutionand at a flow rate of 1mL/min, temperature of column at 25C, the UVdetector was employed to monitor ， the linear correlation coefficients were above column effluent at 254nm. Results

5、 indicated that ： Acetyl - CoAand other substances were completely separated and determined in 17min 0.9995 in the range of 0.011 0.359 mol/mL. The limit of detection of acetyl coenzyme A was 0.28mg/L the limit of quantitation of ， the recovery of acetyl coenzyme A was 0.32mg/L. Under these optimize

6、d conditions the Acetyl -CoA in Lactobacillus bulgaricus at three spiked levels were in the range of 94.8%103.3% with the relative standard deviations(n=6) of 0.75%. This method was fast and accurate for the quantitative analysis of the Acetyl-CoA in Lactobacillus bulgaricus. Key words： high perform

7、ance liquid chromatography (HPLC；Lactobacillusbulgaricus ； Acetyl-CoA 中图分类号： TS201.3 文献标识码： A 文 章 编 号： 1002-0306 (2013)22-0058-05 收稿日期： 2013 06 04 * 通讯联系人 作者简介：李培照( 1986- ),男,硕士研究生,研究方向：乳酸菌代谢。 基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金新教师类资助课题 ( 20122325120022)；国家自然科学基金项目( 31201397)。 保加利亚乳杆菌与人类生活关系密切,无论在 食品发酵,还是工业乳酸发酵以及医

8、疗保健领域,都 被广泛应用,其中最重要的是在牛乳发酵剂方面的 应用 1-2 。这些应用都与保加利亚乳杆菌的代谢有直 接关系,乙酰辅酶 A ( Acetyl-CoA )是三大营养物质 糖、脂肪、蛋白质代谢的枢纽物质,是代谢途径中的 一种重要辅因子,参与微生物中上百个中间代谢反 应 3 ,如：脂肪酸的合成与分解 氨基酸代谢 生酮作 用 、甾醇合成和萜类代谢 4-6 ，它是代谢中所有大分子 的 “接受、装运部门”，并且调控代谢中一些关键酶 7 。 在保加利亚乳杆菌中 Acetyl-CoA 主要有三大去向： 转化成乙醛(一种重要风味物质) 、转化成丙二酰辅 酶A,进入脂肪酸合成途径以及转化成乙酰乙酰辅

9、酶 A ,进入甲羟戊酸途径 o 这三大途径在保加利亚乳杆 菌的生理性能方面各自发挥着重要作用。例如，当保 加利亚乳杆菌处在恶劣环境下时，可通过提升胞内 Acetyl-CoA 的含量，调节脂肪酸合成途径来改变细 胞膜构成成分及流动性以抵抗不利因素，维持生存 o 因此， Acetyl-CoA 的定量对这三大途径碳流量分配 的研究有重要作用，可以通过调节不同途径的代谢 通量来满足所需，而胞内 Acetyl-CoA 的定量是其研究 的前体 。 综上所述，建立一种快速 高效定量 Acetyl-CoA 58 分 析 检 测 2013 年第 22 期 Vol . 34 , No . 22 , 2013 的方

10、法对物质代谢的研究有一定的意义 。 先前报道 的短链酰基辅酶 A 检测方法包括放射性底物酶反 应 8-10 和紫外检测的毛细管电泳 11 o 这些方法的灵敏 度 样本检测含量和动力学范围有一定的限制 。 有报 道用气质联用可以灵敏检测乙酰辅酶 A 12-14 ，但此方 法稍显繁琐，要求乙酰辅酶 A 水解及衍生等，可能会 影响定量测定的准确性 。 目前，国内有利用高效液相 色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS对植物组织中的 Acetyl-COA 定量的报道 15 HP LC测定保加利亚乳杆 菌胞内 Acetyl-CoA 国内少有报道,本研究的目的是 建立一种快速 、准确定量乳酸菌胞内 Acet

11、yl-CoA 的 高效液相色谱法,为乳酸菌胞内 Acetyl-CoA 代谢的 研究提供技术支持。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 乙腈 色谱纯,超纯水(电阻率为 18.2MQ );二 硫苏 糖 醇 Amresco 公 司 ； Acetyl -CoA 钠 盐( CAS 102029-73-2 ) Sigma 公司；其他试剂 分析纯；菌 种德氏乳杆菌保加利亚亚种 ATCC 11842; MRS培 养基 葡萄糖 20g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉 5g、柠檬酸氢二铵 2g、无水乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、 MgSO 4 7H 2 O 0.58g 、 MnSO 4 4H 2 O 0.25g

12、 、吐温 -80 1mL ， 加入1L蒸馏水充分溶解后，调pH6.2 0.2 , 1X 10 5 Pa,灭 菌 15min 备用。 高效液相色谱仪 美国 Waters2695 高效液相色 谱系统,配备真空脱气机 、四元泵、 2487 紫外检测器； SYNERGY超纯水仪美国Milli pore GKDV高功率恒温数控超声波清洗器 仪器有限公司。 1.2 实验方法 1.2.1 样品处理与测定 参照 Vadali RV 等 16 的方法 GL-21M高速冷冻离心机上海市离心机械研究所； 公司； KQ -800 昆山市超声 略做改动。150mL发酵液以8000r/min、4C离心10min, 20m

13、L PBS缓冲液洗涤两次，5mL PBS悬浮沉淀，立即 放入液氮中冷冻 3min , 37C水浴，冻融重复两次（利 于后续破壁）。以8000r/min、4C离心10min,弃上清 液。加入2mL含有2mmol/L二硫苏糖醇的6%的高氯酸 溶液，促进细胞溶解，此混合物超声波处理15min，以 12000r/min、4C离心10min除去细胞碎片及变性蛋 白。上清液转移到预冷的10mL离心管中，逐滴加入 3mol/L K 2 CO 4 溶液（添加的过程中漩涡振荡使其充分 混匀）调 pH为3,以12000r/min、4C离心10min除去 KClO 4 晶体。上清液转移到 EP管中，0.22卩m针头

14、式过 滤器过滤, -20C贮存，用于 HPLC 1.2.2 色谱条件 色谱柱为 Hypersil ODS2 （ C 18 ）柱 5m 4.6mnrt 250mm （大连依利特） ,流动相：缓冲液 A （ 0.2mol/L 磷酸钠，pH5.0）和缓冲液 B （800mL 0.25mol/L 磷酸钠, pH5.0和200mL乙腈）。梯度洗脱，流速 1mL/min , 柱温 25 C ,紫外检测波长 254nm ,进样量 101 L。 1.2.3 标准溶液配制与曲线绘制 精确称取一定量 的 Acetyl-CoA钠盐于lOmL容量瓶里，超纯水溶解并 定容，使终浓度为 0.359mol/mL 作为标品储

15、备液，若 不立即使用， -20C贮存（一周左右有效）。精密吸取 储备液依次稀释 2、4、8、16、32倍，以峰面积为纵坐 标， Acetyl-CoA 的摩尔浓度为横坐标做标准曲线，求 出直线回归方程。 1.2.4 定性与定量 在相同条件下，将样品色谱图 与标准品色谱图对照，根据保留时间确定样品中目 标峰，在标准品与样品进样量相同的条件下，应用外 标法定量，计算样品中 Acetyl-CoA 的含量 。 2 结果及分析 2.1 标准物质的确定 在 标准溶液 16.515min 。 线性回归方程为 1.2.1 色谱条件下测定 Acetyl-CoA （图 1 ），确定 Acetyl-CoA 的保留时间

16、为 Acetyl - CoA 的标准曲线见图 2 ， y =6 X10 6 x -12914 ， R 2 =0.9995 ， Acetyl -CoA 在 0.011 0.359 1 mol/mL 范围内的线性关系良好 o 1.2 液相色谱条件的选择 1.2.1 流动相的选择 磷酸盐缓冲液是反相色谱柱 上应用较广的流动相，本实验选择磷酸钠和磷酸钾 溶液作为流动相比较分离情况。结果表明，这两种缓 冲液都可以很好地分离 Acetyl-CoA ，但在相同浓度 下，磷酸钠为流动相时，样品中 Acetyl-CoA 的响应更 大，因此选择磷酸钠为流动相 O 考虑到一般色谱柱要求，使用的流动相 pH 范围 2

17、W pH 9, Acetyl-CoA 又是CoA的乙酰化形式，可以 看作是活化了的乙酸，为保障其稳定性，本实验分别 配制 pH 为 3、4、5、6 的磷酸钠缓冲溶液 。 结果表明， pH 的变化对样品中辅酶 A( CoA)、Acetyl-CoA 、乙酰乙酰 辅酶 A ( Acetoacetyl-CoA ) 丁酰辅酶 A ( Butyryl-CoA ) pH 为 5 及 CoA 其他短链衍生物的分离有较大的影响， 图1 Acetyl-CoA 标准品HPLC分离色谱图 Fig.1 HPL C chromatogram of Acetyl-CoA standard A U 2.00 6.00 10.

18、00 14.00 18.00 0.26 0.24 0.22 0.20 0.18 0.16 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 时间( min ) 1 6 5 图 2 Acetyl-CoA 标准曲线 Fig.2 The standard curve of Acetyl-CoA 峰 面 积 ( 0 5 ) 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 25 20 15 10 5 0 ji mol/mL 59Science and Technology of Food Industry 分析检测 2013 年第

19、22 期 时分离效果较好（见图 3 ），因此本实验选用 pH 为 5 的 缓冲液为流动相 O 2.2.2 柱温的选择 本实验选取 25 C 和 30 C 两个温 度对比进行温度的选择，结果显示，这两个温度对 Acetyl-CoA 的分离效果无明显影响，温度越高，对色 谱柱的损害越大，考虑到对色谱柱寿命的延长，选取 25C作为分离Acetyl-CoA的温度。 2.2.3 流速的选择 设置柱温为 25 C ，分析流动相 流速为 0.8 、 1.0 、 1.2mL/min 时对 Acetyl-CoA 分离效果 的影响（见图 4）。结果显示，流速直接影响 Acetyl-CoA 的分离时间，随流速的增加

20、， Acetyl-CoA 保留时间会 缩短，但流速越高柱压就越高 o 当流速为 1.0mL/min 时， Acetyl-CoA 在 17min 内完成分离且柱压适宜，故 流速选为 1.0mL/min 。 5。 1.2.2 梯度洗脱条件的确定 由于采用等度洗脱难 于将 Acetyl-CoA 与其他物质分离，本实验采用梯度洗 脱。实验中考察了流动相中乙腈的比例对 Acetyl-CoA 分离度、灵敏度和色谱峰形的影响。经多次实验，梯 度洗脱程序见表 1，样品分离色谱图见图 1.2.3 检出限和定量限 检出限和定量限的确定是 根据流动相中样品组分在检测器上峰高与噪音峰高 的比值（即 S/N ）来确定的

21、。在空白样品中加入较低浓 图3不同pH条件下样品色谱图 Fig.3 Chromatogram of sample under different pH 注： 1-CoA； 2-Acetoacetyl-CoA ； 3-Acetyl-CoA ；4 -Butyryl-CoA 。 A U 2.00 6.00 10.00 14.00 18.00 0.090 0.080 0.070 0.060 0.050 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 时间（ min ） A 2 B C D 1 3 4 pH=3 A U 2.00 6.00 10.00 14.00 18.00 0.090 0.

22、080 0.070 0.060 0.050 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 时间（ min ） 2 1 3 pH=4 A U 2.00 6.00 10.00 14.00 18.00 0.090 0.080 0.070 0.060 0.050 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 时间（ min ） 2 1 3 4 pH=5 A U 2.00 6.00 10.00 14.00 18.00 0.090 0.080 0.070 0.060 0.050 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 时间（ min ） 2 1 3 4 pH

23、=6 图4 不同流速条件下 Acetyl-CoA 保留时间 Fig.4 Retention time of Acetyl-CoA under different flow rate A B 2.00 6.00 10.00 14.00 18.00 0.090 0.080 0.070 0.060 0.050 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 时间（ min ） Acetyl-CoA 0.8mL/min 2.00 6.00 10.00 14.00 18.00 0.090 0.080 0.070 0.060 0.050 0.040 0.030 0.020 0.010 0.00

24、0 时间（ min ） 1.0mL/min 2.00 6.00 10.00 14.00 18.00 0.090 0.080 0.070 0.060 0.050 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 时间（ min ） 1.2mL/min Acetyl-CoA Acetyl-CoA 时间（ min） 缓冲液 A（%） 缓冲液 B（ %） 0.00 97 3 5.00 82 18 7.50 72 28 12.50 60 40 18.00 58 42 20.00 97 3 表1 流动相梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program 60 分 析

25、检 测 2013 年第 22 期 Vol . 34 , No . 22 , 2013 图 5样品分离HPLC色谱图 Fig.5 HPLC chromatogram of sample A U 2.00 6.00 10.00 14.00 18.00 0.090 0.080 0.070 0.060 0.050 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 时间（ min ） Acetyl-CoA 度的标准样品，稀释成一系列浓度梯度进行测定，以 S/N 为 3 和 10 时对应的标准溶液浓度来分别确定检出 限和定量限。通过系列浓度获得符合一定数值 S/N 对 应的浓度，准确配制该浓度标

26、准样品来再次确定 。检 出限和定量限分别为 0.28mg/L 和 0.32mg/L 。 1.2.4 精密度、重复性和回收率 以保加利亚乳杆 菌培养至对数末期（ 16h）的菌体为样品，用本方法对 其进行六次重复测定，其峰面积与 Acetyl-CoA 的浓 度见表 2。由表 2 的分析结果可知变异系数较小，本方 法的精密度高（ 5%）,具有良好的重现性。已知浓度 的 Acetyl-CoA 同一样品平行取样 3 次，进行 3 个水平的 加标回收实验,结果见表 3,此方法测定 Acetyl-CoA 含量的加标回收率在 94.8%103.3%。 2.3 样品的测定结果 用此方法对培养 16h （对照组）

27、及培养至 14h 加 2% NaCI刺激2h （处理组）的保加利亚乳杆菌胞内 Acetyl-CoA 进行了分离与定量 o 结果显示，对照组胞 内 Acetyl-CoA 的含量为 5.177 x 10 -5 i mol/mg （占菌体湿 重的比例），处理组胞内 Acetyl-CoA 的含量为 6.845x 10 -5 ji mol/mg ，处理组胞内 Acetyl-CoA 的含量相对于 对照组增加了 32.22%。 3 结论 采用 Hypersil ODS2 （ C 18 ）柱建立了对保加利亚乳 杆菌胞内 Acetyl-CoA 定性与定量的 HPLC 分析方法， 方法的线性范围及分析结果的精密度

28、 重现性和回 收率均能满足胞内 Acetyl-CoA 的检测。实验表明，本 方法具有前期处理简单，避免了气质联用检测胞内 Acetyl-CoA 前期的水解和衍生等繁琐程序；分析速 度快，在 17min 内便可实现乳酸菌胞内 Acetyl-CoA 与 其他物质的完全分离，能及时测出其变化；灵敏度 高，克服了放射性底物酶反应和紫外检测毛细管电 泳等方法检测 Acetyl-CoA 的缺陷。本方法所用设备 在实验室较为常见，操作也较为方便，对 Acetyl-CoA 的代谢研究具有一定意义 o 参考文献 1 Chammas ， Saliba R. Characterisation of lactic a

29、cid bacteria isolated from fermented milk“ laban ”J. International Journal of Food Microbiology ，2006，110（1）： 52-61. 2 shihata A ， shah NP. Influence of addition of proteolytic strains of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus to commeracial ABT starter cultures on texture of yoghurt， exopolysa

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32、Molecular Biology Reviews ， 2005， 69（ l ）： 12-25. 6 Chohnan S ， Furukawa H ， Fujio T ， et al. Changes in the size and composition of intracellular pools of nonesterified coenzyme A and coenzyme A thioesters in aerobic and facultatively anaerobic bacteriaJ. Applied and Environmental Microbiology，1997

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35、ichard L. Measurement of malonyl coenzyme A J. Methods in Enzymology，1975， 35：312-315. 11 Guanshu Liu ， Junnan Chen ，Ping Che ，et al. Separation and Quantitation of Short-Chain Coenzyme As in Biological Samples 分析次数（ n=6） Acetyl-CoA 含量（ 1 mol/mL） 1 0.0268 2 0.0267 3 0.0267 4 0.0272 5 0.0267 6 0.0267

36、 平均值 0.0268 标准偏差 0.0002 相对标准偏差（ %） 0.75 表2 重复性实验结果 Table 2 Repeated experiment results 序号 样品中 Acetyl-CoA 含量（11 mol/mL） 加入 Acetyl-CoA 含量（ 1 mol/mL） 实测值 （ 1 mol/mL ） 回收率 （%） 1 0.0267 0.0130 0.0395 98.46 2 0.0267 0.0260 0.0513 94.8 3 0.0267 0.0520 0.0804 103.3 表 3 样品加标回收率 Table 3 The recovery of spiked

37、 sample （下转第 65 页） 61 分 析 检 测 2013 年第 22 期 Vol . 34 , No . 22 , 2013 by Capillary ElectrophoresisJ. Anal Chem， 2003， 75（ 1）： 78-82. 12 Wolf A ， Wendy Conrad-Kessel ，John Turk. Long-chain fatty alcohol quantitation in subfemtomole amounts by gas chromatography - negative ion chemical ionization mass

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41、种统计分析方法 LDA 分析利用了电子鼻所有传感器的信号以提高其 分类的准确性，更加注重采集的梨醋香气成分响应 值在空间的分布状态及彼此之间的距离分析 o 从图 6 中可以发现，按照线性判别分析方法，第一主成分区 分贡献率为 99.26% ，第二主成分区分贡献率为 0.05%。 第一 、第二主成分总的区分贡献率达 99.31%，因而雪 梨醋和鸭梨醋的区分是非常明显的 o 3 结论 本实验采用电子鼻分析了雪梨醋和鸭梨醋香气 成分 。结果表明，二者的特征性香气成分类似，但雪 梨醋要比鸭梨醋的芳香味略浓郁一些。确定了硫化 物 、有机芳香硫化物、氮氧化合物、甲烷类、醇类、芳 香成分苯类和烷烃类传感器作

42、为雪梨醋和鸭梨醋电子鼻的传感器阵列，在雪梨醋和鸭梨醋香气评价起 主要作用 。采用电子鼻系统中的主成分分析法以及 线性判别法对原始数据进行分析，发现这两种分析 方法均能准确区分出雪梨醋和鸭梨醋。 Loadings 分析 表明 7号传感器对梨醋第一、二主成分的区分贡献率 均最大。在此基础上，可对不同酿酒酵母、醋酸菌及 发酵条件所生产的梨醋进行香气分析，以优化梨醋 酿造工艺和品质监控。 参考文献 1 霍川，刘青青 . 我国果醋的研究现状与发展前景 J. 安徽农 业科学， 2012，40（ 29）： 14470-14472. 2 彭帮柱，岳田利，袁亚宏，等 气相色谱质谱联用法分析 苹果酒香气成分的研究

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