兔眼蓝莓x27园蓝x27的组培快繁技术研究

1、兔眼蓝莓园蓝离体培养增殖技术研究郑伟尉 1，吕锡山 1，慎家辉 1，邵晓岚 1，邵泱峰 2，臧运祥 1(1浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江临安 311300； 2浙江省临安市农业技术推广中心，浙江临安311300)摘 要：本试验以兔眼蓝莓主栽品种 , 园蓝 ?为试材，研究其离体培养增殖技术。基本培养基 为WPM 培养基，添加蔗糖 20g/L ，琼脂 10g/L，pH 为5.2。实验总体分为两个过程：第一步， 在基本培养基中加入 ZT (2mg/L, 4mg/L, 6mg/L) 或 2ip (2mg/L, 5mg/L, 10mg/L) ，共 6个处理， 培养 60d后，观察记录蓝莓腋芽萌发情

2、况，WPM+ZT 4mg/L 更有利于腋芽萌发，各处理中腋芽萌发后生长速度都很慢；第二步，在基本培养基中加入4mg/L 的ZT 及IAA ( 0.1mg/L,0.2mg/L )或IBA (0.1mg/L, 0.2mg/L )，共 4个处理，培养 60d后进行数据统计，发现最佳处理 为WPM+ZT 4mg/L+IBA 0.2 mg/L ，并且芽子长势较好。因此，兔眼蓝莓 ,园蓝?腋芽诱导和生 长的最佳培养基为 WPM+ZT 4mg/L+IBA 0.2 mg/L 。关键字：兔眼蓝莓；组织培养；增殖中图分类号： S663.9 文献标志码： A 文章编号：Study on in vitro Multi

3、plication of Rabbit Eye Blueberry Garden Blue1 1 1 1 2 1 Zheng Weiwei , Lv Xishan , Shen Jiahui , Shao Xiaolan , Shao Yangfeng , Zang Yunxiang(1 College of Agriculture and Food Science, Zhejiang A & F University, Lin?an Zhejiang 311300 ; 2 AgricultureTechnology Extension Center of Lin?an City, Lin?a

4、n 311300 )Abstract: This work studied the in vitro multiplication of rabbit eye blueberry Garden Blue. The basic medium used is WPM plus sucrose 20g/L, agar 10g/L, with pH of 5.2. Two experiments were performed as follows. One was carried out as WPM plus ZT (2mg/L, 4mg/L, 6mg/L) or 2ip(2mg/L, 5mg/L,

5、 10mg/L). Data were collected after 60 days. The results indicate that the best treatment for shoot formation from axillary buds is WPM plus ZT 4mg/L, shoots formed from all treatments grow very slowly. Another was performed as WPM + 4mg/L of ZT supplemented with IAA (0.1mg/L, 0.2mg /L) or IBA (0.1m

6、g/L, 0.2mg/L). 60 days later, we found that the best treatment for shoot formation is WPM+ZT 4mg/L+IBA 0.2 mg/L, and those shoots grow well. As a result, the best medium for shoot formation and growth from axillary buds of Garden Blue is WPM+ZT 4mg/L+IBA 0.2 mg/L.Key words: rabbit eye blueberry; tis

7、sue culture; multiplication 基金项目：浙江省高等学校创新团队项目 “园艺作物品质调控机理及安全生产技术研究 ”( T200916)；浙江省教育厅科研项目 “蓝 莓功能性花青苷成分鉴定与抗氧化活性分析 ”(Y201225611)；浙江农林大学科研发展基金人才启动项目“蓝莓果实花青苷成分 分析及代谢关键基因的克隆” (2010FR089)；浙江农林大学大学生科技创新项目“蓝莓组培快繁技术体系建立” ( 100106)。 作者简介：郑伟尉，女，博士，讲师，研究方向果树生物技术、果品采后生理与贮藏保鲜。电话 E-mail：zhengwwzafu

8、. 通讯作者：臧运祥，男，博士，副研究员，主要从事园艺植物生物技术与分子育种研究。电话 E-mail ：蓝莓又称越桔，是杜鹃花科( Ericaceae)越桔属( Vaccinium L. )植物，果实色泽艳丽、 酸甜适口，营养丰富，被誉为“浆果之王”1 。蓝莓具有清除人体内自由基、增强毛细血管的柔韧性、 预防血栓形成、抵抗泌尿系统感染、抑制癌细胞增殖等保健作用，被联合国粮农 组织确定为世界五大健康食品之一 2-3。蓝莓主要分为兔眼蓝莓、高丛蓝莓、矮丛蓝莓 3 个 类别。 兔眼蓝莓是从野生兔眼越桔( Vaccinium as

9、hei Reade)类品种中选育出来的栽培品种， 果实成熟前其颜色红如兔眼，故名兔眼蓝莓。兔眼蓝莓比较抗旱，耐湿热，但抗寒性较差， 在我国主要分布在华东、 华中、 华南至西南等丘陵地带， 常见于山地林内或灌木丛中， 是酸 性红壤土地上的指示植物 4 。蓝莓的繁殖方法较多，如扦插、实生、分株等。目前，我国栽培的蓝莓在生产上通常采 用扦插方法繁殖，但成活率较低，繁殖速度慢，幼苗长势弱5 。随着生物技术的快速发展，通过组织培养技术快速繁殖蓝莓， 可以在短期内获得大量品质优良的种苗， 大大提高了繁殖 速度。 之前，国内外蓝莓微体快繁技术研究主要集中在高丛蓝莓和矮丛蓝莓上6-12。近几年，关于兔眼蓝莓的

10、组培快繁研究相继出现报道。张长青 、王连润等通过在 WPM 基本培养基上添加 ZT 或 BA ，可获得较高的增值率，不过，主要是通过茎基部愈伤组织的分化进行增殖， 容易导致体细胞变异， 获得突变体植株 13-14 。王大平等以不同品种的外植体为材料， 研究了 离体培养的芽诱导效果，发现茎段诱导效果较好，不过，增殖效率比较低 15 。因此，本试 验将以优良的兔眼蓝莓品种园蓝 为试材，通过在 WPM 基本培养基中添加不同的细胞分 裂素或与生长素的组合， 筛选最佳离体培养增殖培养基， 为兔眼蓝莓的组培快繁提供依据与 技术支持。1 材料与方法1.1 试验材料试验于 2010 2011 年在浙江农林大学

11、农业与食品科学学院园艺学基础实验室进行，以 兔眼蓝莓品种 ,园蓝 ?的茎段为试材，材料取自浙江农林大学官塘实验基地。1.2 试验方法1.2.1 培养基配制本试验所用基本培养基为 WPM 培养基，添加蔗糖 20 g/L ，琼脂 10 g/L ，依据各处理的 要求添加相应激素，调节 pH 至 5.2，在 121条件下高压灭菌 20 min 后，分装到培养皿中。1.2.2 无菌苗培养体系建立2010年9月份从田间生长良好的 ,园蓝 ?树体上选取半木质化的绿枝作为初始外植体，在 超净工作台上将枝条切成 34cm的茎段，确保每个茎段上带有 1 2个隐芽。将外植体用清水 冲洗 34h，先后经 70%酒精消

12、毒 40s、0.1%的升汞溶液浸泡 68min 、无菌水冲洗 34次后， 置于无菌滤纸上，吸去表面水分并晾干，接种于无激素的固体 WPM 培养基上。培养条件为 16 h光培养、 8 h暗培养，光强为 2500 lx，温度 25。经过一段时间的培养后，将无污染茎段 上长出的新枝条经过多次继代培养，获得足够的材料用于后面的芽诱导试验。1.2.3 试验设计在 WPM 培养基中添加不同激素，接种带有 3个腋芽的 ,园蓝 ?茎段，进行芽诱导培养。 试验分两步进行，首先在 WPM 培养基中加入 ZT（ 2mg/L 、4mg/L、6mg/L ）或 2ip（ 2mg/L 、 5mg/L 、10mg/L ），共

13、六个处理，然后在第一步的最佳处理中添加IAA （ 0.1mg/L 、0.2mg/L ）或 IBA （ 0.1mg/L 、0.2mg/L ），共四个处理，统计数据，筛选最佳腋芽诱导培养基配方。所 有处理每个月继代一次。1.2.4 数据统计与分析外植体培养 60 天后调查外植体萌芽率和腋芽萌发数。外植体萌芽率 =萌芽外植体数 /接种数 100%平均萌发芽数 =萌发芽数 /萌芽外植体数 本试验统计的数据均为三次重复的平均值加标准差。数据采用 SAS 软件系统（ package program 9.1 ，SAS, Inc., USA ）进行方差分析。2 结果与分析2.1 细胞分裂素对 ,园蓝?腋芽诱导

14、的影响细胞分裂素（ cytokinin ）不仅可以促进植物组织的分化，还可以抑制顶端优势，促进 腋芽的萌发。 因此，本试验通过在蓝莓组织培养中常用的 WPM 基本培养基中添加不同浓度 的ZT （玉米素）或 2iP（异戊烯基腺嘌呤），研究这两种细胞分裂素对兔眼蓝莓园蓝腋 芽诱导与生长的影响。由表 1结果可以看出，添加 ZT 的三个处理平均萌芽率为 67.9%，明显 高于添加 2ip处理的 40.3%，因此， ZT 更有利于诱导 园蓝腋芽萌发。从每个外植体的平 均腋芽萌发数也可以看出， 添加ZT的处理为 1.36，也要高于添加 2ip的平均萌发数。 添加2ip 的三个处理中，萌芽率和平均萌发数相差

15、不大。不过，在添加 ZT的处理中，随之 ZT 浓度提 高，萌芽率先升高后降低，以 3mg/L 为最适宜诱导浓度，萌芽率达到 86.7%，平均萌发数也 是最高。 因此，只添加细胞分裂素时， 兔眼蓝莓园蓝 的最佳腋芽诱导培养基配方是 WPM + ZT 4mg/L 。表1 ZT与2ip对兔眼蓝莓园蓝腋芽诱导的影响处理激素浓度 /（mg/L）外植体数 /个平均萌发芽数 /个激素类型萌芽率 /%12605 0.262ZT4607 0.1036607 0.1742609 0.0852ip5602 0.136

16、10602 0.19注：表中数据为 3 次重复的平均值 标准差。表 2 同。图 1 兔眼蓝莓园蓝在不同激素处理中腋芽萌发与生长情况A. WPM+ZT 4mg/L ； B. WPM+2ip 5mg/L ； C. WPM+ZT 4mg/L+IAA 0.2mg/L ；D. WPM+ZT 4mg/L+IBA 0.2mg/L2.2 ZT 与生长素组合对 ,园蓝 ?腋芽诱导的影响虽然在 WPM 培养基中添加细胞分裂素 （ ZT 或 2ip）可以诱导腋芽萌发，但是腋芽萌发 后生长速度非常缓慢 （图 1 A、B）。因此，本试验通过在上述最佳诱导培养基 WPM + ZT 4mg/L 中添加不

17、同浓度的 IAA （吲哚乙酸）或 IBA （吲哚丁酸） ，研究 ZT 与生长素组合对兔眼蓝 莓园蓝腋芽诱导与生长的影响。由表 2 结果可以看出，添加生长素后，腋芽的萌发率进 一步提高，并且腋芽的生长速度要显著高于只添加细胞分裂素的培养基（图1）。添加 IBA的两个处理平均萌芽率为 92.9% ，高于添加 IAA 处理的 86.7%，因此， IBA 更有利于诱导 园蓝腋芽萌发。从每个外植体的平均腋芽萌发数也可以看出，添加 IBA 的处理为 2.0， 也要高于添加 IAA 的平均萌发数 1.55。虽然 IBA 更有利于腋芽的诱导，不过，腋芽的生长 速度要低于添加 IAA 的培养基（图 1 C、D

18、）。综合考虑，兔眼蓝莓园蓝的最佳腋芽诱 导培养基配方是 WPM + ZT 4mg/L + IBA 0.2mg/L ，萌芽率和平均萌发数均为各处理中最高。表 2 ZT 与 IAA/IBA 组合对兔眼蓝莓园蓝腋芽诱导的影响处理激素浓度 /（mg/L）外植体数 /个平均萌发芽数 /个激素类型萌芽率 /%1IAA0.16081.7 6.11.75 0.1920.26091.7 4.61.35 0.163IBA0.16087.5 3.21.77 0.2040.26098.3 2.92.23 0.22注：以上四个处理中，每个处理都加入 4mg/L 的 ZT 。3 结论（1）ZT（玉米素）诱导兔眼蓝莓腋芽萌

19、发的效果要好于2ip（异戊烯基腺嘌呤），对于园蓝的诱导以 4mg/L 为宜。（2）本试验首次以 ZT 与较低浓度的生长素（ IAA 或 IBA ）组合研究兔眼蓝莓园蓝的 腋芽萌发及长势情况。 ZT 与 IBA 组合使用，腋芽的萌发率与萌发数均高于 ZT 与 IAA 的组 合，不过，腋芽萌发后的长势则相反。（3）ZT 与生长素组合诱导兔眼蓝莓 园蓝 腋芽萌发的效果明显好于只添加细胞分裂素的 处理，腋芽萌发率与萌发数均显著提高，并且，腋芽萌发后的长势良好。（4）兔眼蓝莓园蓝的最佳腋芽诱导培养基是WPM + ZT 4mg/L + IBA 0.2mg/L 。4 讨论4.1 细胞分裂素对蓝莓芽诱导的影响

20、蓝莓芽诱导常用的细胞分裂素有 ZT、2ip 、6-BA 等，不过 6-BA 的诱导效果很差， 因此， 本试验中并没有采用添加 6-BA 的处理15-16 。王大平、涂俊凡等研究发现， ZT 和2ip对兔眼 蓝莓芽诱导均有效， ZT 1 4mg/L 或 2ip 1020 mg/L 均能较好地诱导兔眼蓝莓腋芽的萌发， 添加 ZT 的诱导效果要好于添加 2ip 的处理，这与我们的研究结果是一致的，不过差异不像 我们的研究结果那么大 15-16。另外，他们发现 ZT 2mg/L 最适宜诱导蓝莓腋芽萌发，不过， 本试验结果为 4mg/L ，这可能与试验材料的基因型差异有关。4.2 生长素与细胞分裂素组合

21、对蓝莓腋芽诱导的影响生长素不仅可以促进枝条的生长， 而且浓度较低时还可以诱导根系形成或与细胞分裂素 配合使用诱导愈伤组织分化或腋芽的萌发与生长。王连润等以1/2WPM + IBA 0.1mg/L 作为蓝莓的根系诱导培养基，生根率达到7090%13。涂俊凡等 16研究发现， WPM + ZT 或 2ip的培养基中添加 IAA 4mg/L ，萌发腋芽的生长速度较快并且粗壮、 叶色由淡黄或淡绿色转至 绿色，不过，腋芽的萌发率并没有发生变化。本试验首次通过在 WPM + ZT 4mg/L 的培养 基中添加较低浓度的 IAA 或 IBA 进行蓝莓腋芽诱导研究， 发现这一组合不仅显著提高了腋 芽的萌发率，

22、而且腋芽萌发数也得到显著提高（表2）。因此，与细胞分裂素一起使用进行蓝莓腋芽诱导时，生长素应以较低浓度比较合适。下一步研究可以以多个蓝莓品种为试材， 分析细胞分裂素与生长素组合对其腋芽诱导效果， 为蓝莓的组培快繁及工厂化育苗提供理论 依据与技术支持。参考文献1 葛翠莲 ,黄春辉 ,夏思进 ,等 .10个蓝莓品种主要营养成分与色素含量分析J. 中国南方果树 ,2012,41(4): 33-352 张玉萍 .越橘的保健作用及其在我国的开发利用前景J.山西农业科学 ,2006,34(4): 22-253 於 虹 ,贺善安 ,顾 姻.我国和世界蓝浆果的发展前景 J.植物资源与环境学报 ,2001(10

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