定量PCR技术实验解析PPT课件

1、实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术研究进展与应用技术研究进展与应用 实时荧光定量PCR技术原理 实时定量PCR技术研究进展与应用 基因表达分析定量 多态性检测（SNP分析）定性 定量PCR实验技术解析 实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理的原理 普通普通PCR技术技术 实时荧光定量实时荧光定量PCR的检测原理的检测原理 两者的区别两者的区别 常规常规PCRPCR 常规常规PCRPCR技术：技术： 对对PCR扩增反应的扩增反应的终产物终产物进行定性分析进行定性分析 S1 S2 M DNA Engine 在在PCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用荧光信号，利用荧光信号 累积

2、累积实时监测实时监测整个整个PCR进程，最后通过标准曲线进程，最后通过标准曲线 对未知模板进行定量分析的方法对未知模板进行定量分析的方法 实时荧光定量实时荧光定量PCR定义定义 什么是荧光什么是荧光 原子核，电子原子核，电子 能级，稳定能级，稳定 电子被激发（高能量的光线，热量电子被激发（高能量的光线，热量） 到高能级，不稳定到高能级，不稳定 电子回到低能级，放出能量（光，热）电子回到低能级，放出能量（光，热） 可见光范围，荧光可见光范围，荧光 基本结构基本结构 光源光源 光学光学 元件元件 反应管反应管 光学光学 元件元件 热循环仪热循环仪 常规常规vs实时实时 常规常规PCRPCR：借助电

3、泳对扩增反应的：借助电泳对扩增反应的终产物终产物进行半定进行半定 量及量及定性定性分析分析 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术：利用技术：利用荧光信号的变化实时荧光信号的变化实时 检测检测PCRPCR扩增反应中扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化每一个循环扩增产物量的变化， 最终精确的对最终精确的对起始模板起始模板的定量分析的定量分析 MJ Research 常规常规vs实时实时 优缺点比较优缺点比较 优势来自：优势来自： 实验数据及定量分析方法实验数据及定量分析方法 荧光实时监测产物浓度荧光实时监测产物浓度 实时荧光定量PCR常规PCR 荧光实时分析每一次循环产物凝胶电泳分析终产物 精

4、确计算初始模板浓度，灵敏 度高，检测单拷贝模板 通过终产物定性分析模板 计算机自动纪录分析检测方法费时费力 实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理 定量原理定量原理 如何对起始模板定量？如何对起始模板定量？ 通过通过Ct值和标准曲线对值和标准曲线对起始模板起始模板进行定量分析进行定量分析 介绍三个概念：介绍三个概念： 扩增曲线、荧光域值、扩增曲线、荧光域值、CtCt值值 实验数据实验数据 指数扩增期 实时荧光实时荧光PCR荧光曲线图荧光曲线图 循环数，荧光值循环数，荧光值 指数扩增期，非指数扩增期指数扩增期，非指数扩增期 非指数扩增期 扩增产物 荧光曲线 域值（Threshold）线荧光扩增曲

5、线荧光扩增曲线指数增长期指数增长期设定的一个设定的一个荧光荧光 强度强度标准（标准（PCR扩增产物量的标准）扩增产物量的标准） C(t)（Count of Threshold）值荧光信号（扩增产物）到达域值荧光信号（扩增产物）到达域值 时所经过的扩增时所经过的扩增循环次数循环次数 域值线域值线 C(t)值值 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术研究进展与应用技术研究进展与应用原理篇原理篇 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术研究进展与应用技术研究进展与应用原理篇原理篇 C(t)值： 对于同一PCR反应而言，模板浓度相同时， C(t)值极具 重复性； 对于同一PCR反应而言中，模板浓度越

6、高，到达某一域 值时对应的C(t)值就越小，反之，则越高； 在指数增长期内，初始模板的Log浓度与c(t)值呈 线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数 （即C(t)值）就可计算出样品中所含的模板量。 定量原理定量原理 浓度的对数值浓度的对数值与与循环循环 数数呈呈线性关系线性关系，根据，根据 样品扩增达到域值的样品扩增达到域值的 循环数就可计算出样循环数就可计算出样 品中所含的模板量品中所含的模板量 定量方法：初始模板量的对数与定量方法：初始模板量的对数与C(T)循环数之间呈线循环数之间呈线 性关系性关系 106 105 104 103 102 10 未知样品包 含约3600个 拷贝 实时荧光

7、定量实时荧光定量PCRPCR技术研究进展与应用技术研究进展与应用原理篇原理篇 荧光信号如何产生？荧光信号如何产生？荧光化学试剂荧光化学试剂 非特异性非特异性 -SYBR Green I 特异性特异性 -TaqMan 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术研究进展与应用技术研究进展与应用原理篇原理篇 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术研究进展与应用技术研究进展与应用原理篇原理篇 SYBR Green 工作原理 q SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green q SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 q 变性时，DNA双链分开，无荧光 q 复性

8、和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光， 在此阶段采集荧光信号。 53 53 SG No Emission SG SG SG ExcitationExcitation SG SG SGSGSG SGSG 53 53 Emission ExcitationExcitation SYBR Green 法 -PCR反应的建立 反应体系的建立及优化: 1.SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太 弱，不易检测 2.Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3.MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 4.反应Buffer

9、体系的优化 5.反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6.其他与常规PCR相同 SYBR Green SYBR Green 法法 应用范围应用范围 q 起始模板的测定 q 基因型的分析 q 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对 常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以 区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产 物。 利用SYBR Green 法定量检测样品DNA 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术研究进展与应用技术研究进展与应用原理篇原理篇 TaqManTaqMan探针探针 与目标序列互补 v 5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 v 3端标

10、记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) v 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧 光 v Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针 Forward Primer Reverse Primer Q R 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术研究进展与应用技术研究进展与应用原理篇原理篇 TaqMan TaqMan 探针探针 PCRPCR反应的建立反应的建立 1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定： 一般为：94 ，10

11、-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高） 也可通过温度梯度优化退火温度 72 ，45 S， 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM 4、其他与常规PCR相同 TaqManTaqMan探针探针 应用范围应用范围 q 起始模板的定量 q 基因型分析 q 目的基因定量 q 产物鉴定 q SNP分析 小结小结 实时荧光定量实时荧光定量PCR 各种荧光监测方法的原理各种荧光监测方法的原理 实时荧光数据结果的初步分析实时荧光数据结果的初步分析 C(t)值值 线性关系线性关系 实时荧光定量实时荧光定量P

12、CRPCR技术研究进展与应用技术研究进展与应用 实时荧光定量PCR技术原理 实时定量PCR技术研究进展与应用 基因表达分析定量 多态性检测（SNP分析）定性 定量PCR实验技术解析 绝对定量与相对定量绝对定量与相对定量 绝对定量：精确的计算初始反应的模板绝对定量：精确的计算初始反应的模板 浓度（浓度（DNA，RNA） 病毒病毒DNA或或RNA的拷贝数的拷贝数 转基因的拷贝数转基因的拷贝数 相对定量：计算初始反应模板的相对含相对定量：计算初始反应模板的相对含 量量 差异表达分析差异表达分析 芯片评估芯片评估 转基因生物的检测转基因生物的检测 基因型检测基因型检测 实时荧光定量实时荧光定量PCRP

13、CR技术研究进展与应用技术研究进展与应用应用篇应用篇 基因表达差异 绝对定量标准品（病毒检测， GMO检测等） 相对定量 外标法内对照与待检目标在两个管中进行 同时扩增 内标法内对照与待检测目标在同一管中进 行扩增 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术研究进展与应用技术研究进展与应用应用篇应用篇 样本样本A核酸提取核酸提取 样本样本B核酸提取核酸提取 目标基因标准曲线目标基因标准曲线 内标准基因标准曲线内标准基因标准曲线 定量定量 样本样本A中看家基因拷贝数中看家基因拷贝数 样本样本A中目标基因拷贝数中目标基因拷贝数 样本样本B中目标基因拷贝数中目标基因拷贝数 样本样本B中看家基因拷贝数中

14、看家基因拷贝数 均一化处理均一化处理 看家基因的表达看家基因的表达 水平恒定水平恒定 目标基因的表达差异目标基因的表达差异 相对定量相对定量 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术研究进展与应用技术研究进展与应用应用篇应用篇 实验举例 ERBB2 在癌组织以及正常组织中的表达差 异 用GAPDH做为看家基因做均一化处 使用 TaqMan 探针进行双通道荧光定量 FamFam ERBB2 VIC VIC GAPDH 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术研究进展与应用技术研究进展与应用应用篇应用篇 荧光荧光 1 FAM 检检 测测ERBB2标准标准 曲线曲线 荧光荧光 2 - VIC 检测检

15、测 GAPDH标准曲标准曲 线线 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术研究进展与应用技术研究进展与应用应用篇应用篇 GAPDH 看家基因的扩增曲线看家基因的扩增曲线 癌组织癌组织 健康组织健康组织 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术研究进展与应用技术研究进展与应用应用篇应用篇 ERBB2目标基因的扩增曲线目标基因的扩增曲线 癌组织癌组织 健康组织健康组织 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术研究进展与应用技术研究进展与应用应用篇应用篇 均一化表达均一化表达 0 1 2 3 4 5 6 正常组织癌组织 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术研究进展与应用技术研究进展与应用应用篇应

16、用篇 实时荧光定量PCR在基因表达差异中的应用： 调控机制的研究 信号通路的研究 RNAi结果的验证 细胞生理状态变化的研究 发育生物学 癌基因和抑癌基因的研究 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术研究进展与应用技术研究进展与应用 实时荧光定量PCR技术原理 实时应用定量PCR技术研究进展与应用 基因表达定量 多态性检测（SNP分析）定性 定量PCR实验技术解析 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术研究进展与应用技术研究进展与应用应用篇应用篇 SNPs是指在基因组水平上由于单个核苷酸位 置上存在转换或颠换变异所引起的DNA序列 多态性 SNP共有4种形式,其中CT(GA)转换常见, 约

17、占2/3,其余3种置换为CA(GT)、 CG(GC)和TA(AT) SNP占所有已知多态性的90%以上，SNP在人 类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱 基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至 更多 What is SNP (single nucleotide polymorphism) 0.3% of human genome = 10 million SNPs 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术研究进展与应用技术研究进展与应用应用篇应用篇 进行疾病的遗传连锁分析(linkage analysis)及关联分析 (association analysis)，用于疾病易感基因

18、定位；而且其 定位的精度将比微卫星标记精细得多，可直接用于指 导易感基因克隆。 在“药物基因组学”(pharmacogenomics)研究中，可 通过检测SNP的遗传多态性标记揭示人群中不同个体 对不同药物的敏感性差异的根本原因。 也可用于法医研究的罪犯身份的鉴别、亲子鉴定等， 此外在器官移植中供体和受体间的配对选择及物种进 化的研究中都将具有重要意义 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术研究进展与应用技术研究进展与应用应用篇应用篇 定量定量PCRPCR方法研究方法研究SNPSNP位点位点 双双TaqmanTaqman探针法探针法 F R FQ G VQ T C SNP G/A FQ G

19、VQ T Forward primer Reverse primer Allele-specific probe Allele-specific probe 双双Taqman探针法探针法 两条探针分别针对不同等位基因 SNP placed in the center of the probe Quencher; TAMRA or MGB/NFQ* 野生型野生型 (wt) 突变型突变型 (mut) G C C T 双双Taqman探针法检测野生型和突变型探针法检测野生型和突变型 在基因型分析中，可采用两种不同的Taqman探针（分别针对野生型和 突变型)，即一个探针以一种荧光素（Flr）标记，而

20、另一个探针则用不同 的荧光物（Tet）标记。如果只有一种信号被扩增出来，则样本为对应的基 因型（野生型或突变型）的纯合子；如二者都被有效地扩增出来，则样本 为杂合型。 杂合体个体的杂合体个体的DNA扩增产物则可同时与扩增产物则可同时与Tet和和Flr标记的探针结合标记的探针结合 同型突变型个体的扩增同型突变型个体的扩增DNA只与只与Tet或或Flr标记的探针结合标记的探针结合 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术研究进展与应用技术研究进展与应用 实时荧光定量PCR技术原理 实时应用定量PCR技术研究进展与应用 基因表达定量 多态性检测（SNP分析）定性 定量PCR实验技术解析 实验方案设计

21、 普通PCR实验条件的优化 定量PCR实验条件的优化 定量PCR常见实验问题的处理 定量PCR实验技术解析 实验方案设计确定实验的目的 两个明确： 1.明确需要的是绝对定量还是相对定量； 2.明确是否采用质粒系统进行定量。 定量PCR实验技术解析 实验方案设计详细理解实验分组 1.如果是绝对定量简单，直接用标准曲线 2.如果是相对定量，要明确需要进行比较的组 间和组内样本（是否采用一组或一个样本作为全部 实验的对比组） 定量PCR实验技术解析 实验方案设计 普通PCR实验条件的优化 定量PCR实验条件的优化 定量PCR常见实验问题的处理 定量PCR实验技术解析 普通PCR优化最终目的保证实验的

22、特异性 1.引物设计三原则紧密互补、无引物二聚 体、无错配； 2.反应温度的优化梯度PCR实验 定量PCR实验技术解析 梯度与非梯度实验对比 63.4C到71.0C之 间进行退火温度的优 化，在同一模块上进 行 6个独立的PCR反应， 分别应用不同的退火温 度 温控速率结结果无显著 的影响 Annealing gradient 退火15秒， 95变性30秒 63.4C71.0C 2.0 kb 1.0 kb 2.0 kb 1.0 kb 63.4C71.0C 优化变性温度有时也是重要的 优化变性温度可以提高 产率. 94C 并非总是最佳的 退火温度 60退火60秒，95变性30秒 AmpliTaq

23、 Gold (5u) 6 kb 90.0 C 90.2 90.6 91.4 92.3 93.5 94.8 95.9 96.8 97.4 97.8 98.0 多重PCR反应中优化温度 53-57C 减少非特异性条带. 49C66C 1000 600 400 200 100 800 Annealing 15 sec, Denaturing 92C for 30 sec. 普通PCR优化最终目的保证实验的特异性 3.其它条件的优化 Mg2浓度的优化、引物浓度的优化、模板的 优化等 定量PCR实验技术解析 实验方案设计 普通PCR实验条件的优化 定量PCR实验条件的优化 定量PCR常见实验问题的处理

24、定量PCR实验技术解析 定量PCR实验的优化 SYBR Green I Taqman的实验优化 定量PCR实验技术解析 定量PCR实验的优化SYBR Green I 基本要求：产物大小在150300bp间比较合适；对 GC含量没有特别的要求。适用于大多数的定量PCR 实验需要。 定量PCR实验技术解析 定量PCR实验的优化SYBR Green I 1.普通PCR的实验条件摸索很重要目标是达到 没有非特异性的扩增； 定量PCR实验技术解析 定量PCR实验的优化SYBR Green I 2.普通PCR无法达到完全的优化利用读板温度 设定解决 前提：没有Tm值高于目的产物的非特异产物 定量PCR实验

25、技术解析 l存在非特异性产物时的熔解曲线 目的产物目的产物 非特异性产物非特异性产物 优化读板温优化读板温 度，在两个度，在两个 TM值间读板值间读板 定量PCR实验技术解析 定量PCR实验的优化 SYBR Green I Taqman的实验优化 定量PCR实验技术解析 定量PCR实验的优化TaqMan 基本要点：对实验设计要求较高，引物要与探针相 匹配；扩增的长物片段一般为120200bp左右；结 合的唯一性。 定量PCR实验技术解析 定量PCR实验的优化TaqMan 1.探针设计 探针长度在1520个bp长度间合适，不超过25个 bp； 探针的Tm值比引物的要高510，可以应用 MGB；

26、探针的结合位点要靠近5端； 定量PCR实验技术解析 1 1 确保确保G-CG-C含量在含量在20-80%20-80%之间。之间。 2 2 探针探针5 5 端的第一个碱基不能是端的第一个碱基不能是G G, G, G可以淬灭可以淬灭FAMFAM基团所基团所 发出的荧光信号发出的荧光信号 。 3 3 用用Primer ExpressPrimer Express软件计算出来的探针软件计算出来的探针TmTm值应当在值应当在68-68- 7070C C 之间之间。 4 4 探针要尽可能地短，但是不要短于探针要尽可能地短，但是不要短于1313个碱基。个碱基。 5 5 避免同一碱基重复过多，特别是避免同一碱基

27、重复过多，特别是G G，不可超过，不可超过4 4个及以个及以 上。上。 6 6 尽量使含尽量使含C C多于含多于含G G的探针。如果的探针。如果C C少于少于G G，则使用互补，则使用互补 链上的探针。链上的探针。 7 7 如果是如果是SNPSNP，多态位点尽量位于探针中央。，多态位点尽量位于探针中央。 定量定量PCR实验的优化实验的优化TaqMan 1. 1.在探针确定以后再选择引物。在探针确定以后再选择引物。 2. 2.引物要尽可能地接近探针，但是不要重叠。引物要尽可能地接近探针，但是不要重叠。 3. 3.保持保持G-CG-C含量在含量在20-80%20-80%之间。之间。 4. 4.避免

28、同一碱基重复过多。特别是避免同一碱基重复过多。特别是G G，不可超过，不可超过4 4个个 及以上。及以上。 5. 5.用用Primer ExpressPrimer Express软件计算出来的软件计算出来的TmTm值应当在值应当在58-58- 6060C C之间。之间。 6. 6.在在3 3 端的端的5 5个碱基中，个碱基中，G G和和C C碱基加起来不要超过碱基加起来不要超过 2 2个。个。 定量定量PCR实验的优化实验的优化TaqMan 实验方案设计 普通PCR实验条件的优化 定量PCR实验条件的优化 定量PCR常见实验问题的处理 定量PCR实验技术解析 常见问题： Q：普通PCR已经优化好条件，但实验中未检测到 荧光曲线的变化？ A：首先考虑是否用同一参数的PCR进行的实验。 如果是用SYBR Green I的话，可考虑增加一些酶量 或改变其它温度、离子浓度等条件。这是因为染料 对聚合酶有一定的抑制作用。如果是探针的话，留 意背景荧光值的大小，以判断是否降解。加大延伸 时间 定量PCR实验技术解析 常见问题： Q：不用质粒如何进行标准曲线？ A：用已经知道浓度的