实验三单向琼脂扩散实验

1、临床免疫学实验指导临床免疫学实验指导 实验二、 单向琼脂扩散试验 【实验原理】 将适量的抗体加入琼脂内制成免疫琼脂板，打孔，在孔中 加入待测抗原，抗原可向四周呈辐射状扩散，当抗原，抗体在 比例适宜时形成白色沉淀环. 沉淀环直径与抗原含量成正比。 用标准抗血清和已知浓度的抗原（或国际参考品）制成标准 曲线。通过测定样品沉淀环直径大小，可从标准曲线中读出抗 原的含量。 本试验主要用于检测标本中各种Ig、补体的含量等，具有高灵敏 性，高特异性特点。 【实验目的与要求】 掌握单向琼脂扩散试验的原理、操作方法、 结果分析及临床应用 【试剂与器材】 1. 1. 羊抗人IgGIgG血清（兔抗人血清，购买）

2、2. 2. 标准参考血清( (标准IgGIgG质控物，购买) ) 3. 3. 待检人血清（IgGIgG抗原） 4. pH7.4 0.01M PBS 4. pH7.4 0.01M PBS缓冲液（或NSNS） 5. 5. 琼脂粉（制备1%1%免疫盐水琼脂液） 6. 6. 载玻片、打孔器、 3737恒温箱、湿盒、 可调微量加样器等 用于制作 标准曲线 【操作注意事项】 1. 1. 制备抗体琼脂板 琼脂温度必须严格控制，温度 太低琼脂会凝固，太高则会影响抗体的活性 2. 2. 加样孔内的琼脂应挑干净，切不可损坏孔的边 缘，确保每孔的液面基本一致 3. 3. 加样精确，不能逸出孔外，否则结果不好观察 4

3、. 4. 加样吸取不同每份标本均应更换塑料吸头 5. 5. 检测过程中，标准曲线必须与样品同步操作 6. 6. 孵育时间应控制在3737，24-4824-48小时，时间太短 或时间太长会影响沉淀线的形成和清晰度。 【标准曲线的制备】由实验教师 1. 1. 购买标准已知浓度的 人血清（IgGIgG抗原） 购买标准羊抗人（兔抗人） 抗人IgG-IgG-抗体（抗血清） 2. 2. 制备1%1%盐水免疫琼脂凝胶板（在反面一角做好标记） 取琼脂粉1.0g1.0g，加NSNS，100ml.100ml.混匀加热溶解成透明液体， 放5656，加入标准抗血清1.01.01.5ml1.5ml，混匀，制板 3. 3

4、. 制板，打孔，孔径3mm3mm，孔距1.2-1.5cm1.2-1.5cm，打5 5个孔。 4. 4. 加样：在各孔分别加不同浓度稀释度人标准血清10L10L 110110， 120120， 140140，180180， 1 :160.1 :160. 稀释 100 mg , 50mg , 25mg , 12.5mg 100 mg , 50mg , 25mg , 12.5mg ，6.25mg. 6.25mg. 浓度 5. 5. 保温反应：将凝胶板放湿盒内，3737反应24h,24h,观察结果. . 6. 6. 用坐标纸制作标准曲线: :以沉淀环直径（m mm m）为纵坐标; ; 以标准浓度的对数

5、值（LgLg）为横坐标绘制标准曲线. . 标准曲线与样品测定结果（实物实拍） 测定样本： 病人血清（ 标本 1. 25mm， 标本 2. 20mm ） 标准曲线制备：标准抗原稀释4 4钟浓度，预温24h24h，沉淀环直径数据 30 m m 30 m m 25 m m 25 m m 20 m m 20 m m 15 m m 15 m m 以沉淀环直径为纵坐标，以抗原标准浓度的对数值（Lg） 为横坐标绘制标准曲线，根据样本测得直径，查出结果。 沉 淀 环 直 径（毫米） 4 2 5 6 7 3 8 标准抗原稀释： 1 ：10， 1 ：20 ， 1 ：40， 1 ：80 ， 1 ：160 相当抗原浓

6、度： 100mg 50mg 25mg 12.5mg 6.25mg/L 沉淀环直径： 7mm 6mm 5mm 4mm 3mm Lg值： 2.0 1.699 1.398 1.097 0.796 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 9 【实验方法】 1. 制备1.0%免疫盐水琼脂液 取琼脂粉1.0g ，加入100ml. NS，混匀加热溶解。 加热时用玻棒不断轻轻搅拌，使成透明液体，放56， 加入 1 : 2 稀释的羊（兔）抗人血清1.25ml，混匀， 56保温备用。 2. 制板： 每2人制作1个凝胶板。 取清洁玻片一张，在背面一角处标记，用5ml或10ml 刻度吸管 ，每片缓慢滴加3.5

7、 - 4.0ml琼脂液，待凝。 3. 打孔： 每玻片打孔两个，孔径3mm，孔距1.0-1.2cm， 用竹签尖将孔内琼脂挑出。 4. 加样： 用NS将血清稀释）10l血清+190l,NS= 1:20 混匀3次，吸出10l + 10l NS= 1;40 向琼脂孔内分别加入:20:20， 1 : 401 : 40 稀释血清各10l 5. 保温反应：将琼脂板放湿盒内，37温育24-48h。 6. 测量沉淀环最大直径，查标准曲线。 计算：血清 IgG (mg/L) =对应的血清IgG含量（稀释倍数） 以沉淀环直径为纵坐标，以抗原标准浓度的对数值（Lg） 为横坐标绘制标准曲线，根据样本测得直径，查出结果。

8、 沉 淀 环 直 径（毫米） 4 2 5 6 7 3 8 标准抗原稀释： 1 ：10， 1 ：20 ， 1 ：40， 1 ：80 ， 1 ：160 相当抗原浓度： 100mg 50mg 25mg 12.5mg 6.25mg/L 沉淀环直径： 7mm 6mm 5mm 4mm 3mm Lg值： 2.0 1.699 1.398 1.097 0.796 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 9 Ag Ag Ag Ag 【结果计算】 n分别量取各孔样品沉淀环的直径，在标准曲 线上查出对应的IgGIgG含量。 n待测血清IgGIgG含量(mg/L)(mg/L) IgG mg/L = IgG mg

9、/L = 标准曲线对应结果4 4（稀释倍数） n参考值: : 成人血清 IgG:IgG: 700-1660mg/L700-1660mg/L (0.7-1.6g/L) (0.7-1.6g/L) 实验报告 1. 简述单向扩散试验测定IgG的实验原理 2. 根据老师提供数据绘制标准曲线 3. 根据检测结果，数据，在标准曲线上查出 相应结果，报告计算公式与测定结果 【实验目的与要求】 掌握单向琼脂扩散试验的原理、操作方法、 结果分析及临床应用 【试剂与器材】 1. 1. 羊抗人IgGIgG血清（兔抗人血清，购买） 2. 2. 标准参考血清( (标准IgGIgG质控物，购买) ) 3. 3. 待检人血清

10、（IgGIgG抗原） 4. pH7.4 0.01M PBS 4. pH7.4 0.01M PBS缓冲液（或NSNS） 5. 5. 琼脂粉（制备1%1%免疫盐水琼脂液） 6. 6. 载玻片、打孔器、 3737恒温箱、湿盒、 可调微量加样器等 用于制作 标准曲线 【标准曲线的制备】由实验教师 1. 1. 购买标准已知浓度的 人血清（IgGIgG抗原） 购买标准羊抗人（兔抗人） 抗人IgG-IgG-抗体（抗血清） 2. 2. 制备1%1%盐水免疫琼脂凝胶板（在反面一角做好标记） 取琼脂粉1.0g1.0g，加NSNS，100ml.100ml.混匀加热溶解成透明液体， 放5656，加入标准抗血清1.01

11、.01.5ml1.5ml，混匀，制板 3. 3. 制板，打孔，孔径3mm3mm，孔距1.2-1.5cm1.2-1.5cm，打5 5个孔。 4. 4. 加样：在各孔分别加不同浓度稀释度人标准血清10L10L 110110， 120120， 140140，180180， 1 :160.1 :160. 稀释 100 mg , 50mg , 25mg , 12.5mg 100 mg , 50mg , 25mg , 12.5mg ，6.25mg. 6.25mg. 浓度 5. 5. 保温反应：将凝胶板放湿盒内，3737反应24h,24h,观察结果. . 6. 6. 用坐标纸制作标准曲线: :以沉淀环直径（

12、m mm m）为纵坐标; ; 以标准浓度的对数值（LgLg）为横坐标绘制标准曲线. . 【标准曲线的制备】由实验教师 1. 1. 购买标准已知浓度的 人血清（IgGIgG抗原） 购买标准羊抗人（兔抗人） 抗人IgG-IgG-抗体（抗血清） 2. 2. 制备1%1%盐水免疫琼脂凝胶板（在反面一角做好标记） 取琼脂粉1.0g1.0g，加NSNS，100ml.100ml.混匀加热溶解成透明液体， 放5656，加入标准抗血清1.01.01.5ml1.5ml，混匀，制板 3. 3. 制板，打孔，孔径3mm3mm，孔距1.2-1.5cm1.2-1.5cm，打5 5个孔。 4. 4. 加样：在各孔分别加不同浓度稀释度人标准血清10L10L 110110， 120120， 140140，180180， 1 :160.1 :160. 稀释