凡纳滨对虾线粒体控制区群体遗传学分析

1、毕业设计（论文）（ 2015 届本科） 题 目： 凡纳滨对虾线粒体控制区群体遗传学分析 学 院： 水产与生命学院 专 业： 生物科学（海洋生物方向） 班 级： 姓 名： 学 号： 指导教师： 年 05 月 目录摘要 .3 ABSTRACT. 3 1绪论. 4 2 材料与方法.42.1研究样品来源及总DNA的提取.42.2 mtDNA控制区基因序列的扩增及测序.42.3 线粒体控制区序列的整理与分析.53 结果.53.1凡纳滨对虾线粒体DNA测序结果.53.2凡纳滨对虾单倍型及单倍型多样性.53.3凡纳滨对虾群体间的遗传分化与遗传距离.73.4 基于mtDNA控制区序列的凡纳滨对虾分子系统树.9

2、4 讨论.104.1凡纳滨对虾种群遗传多样性.104.2凡纳滨对虾的遗传距离和遗传分化.104.3 线粒体DNA标记鉴别不同凡纳滨对虾养殖群体的可行性 .10.5.结论.11参考文献.11凡纳滨对虾的线粒体控制区群体遗传学分析摘要：本研究通过对4个凡纳滨对虾群体即G1、G2、S1、S2的线粒体DNA(mtDNA)控制区部分基因序列的测定，系统的分析了其遗传多样性，对比他们之间系统进化关系。在4个凡纳滨对虾群体共40个样本的线粒体控制区序列中共检测到17种单倍型，其中群体G1和G2单倍型数量最多，分别为8个和6个。S2群体单倍型数最少，仅有1个，S1和S2群体的单倍型个数均为1个。4个群体单倍型

3、多样性（H1）在0.4160.0900.9730.022，其中遗传多样性最高的为G1群体。AMOVE分析结果显示，来自群体间的遗传差异（57.03%）略高于群体内的变异（42.97%）。各群体的遗传分化Fst值均为正值，其中GD组与其他群体之间差异最大。用MEGA5.0基于遗传距离构建系统进化树，结果表明5个凡纳滨对虾群体中，S1和S2遗传距离最近（D=0.017），聚为一支，G2群体聚为一支，G1群体单独聚为一支，4个凡纳滨对虾群体中，4个群体共享单倍型H1，此外，S1和S2共享单倍型H2，G1和G2共享单倍型H11，可能是由于其在选育过程中亲本的遗传背景存在交叉，而G2群体与其他群体遗传距

4、离较远，可能与选择群体样本的地理位置差异相关。关键词：凡纳滨对虾；线粒体DNA控制区基因序列；遗传多样性；单倍型Genetic analysis for Mitochondrial control region groups of VannameiAbstract: The survey have compared and analyzed the relationship between the genetic diversity and systematic revolution by tasting he gene sequence of control region section o

5、f mtDNA of G1, G2, S1, S2 (4 group of Litopenaeus Vannamei). 17 kinds of haplotype was detected in the sequence of mitochondrial control region of the 4 group of Litopenaeus Vannamei in the 40 samples, and the groups of G1 and G2 had the maximum haplotype amount, separately are 8 and 6. Besides, the

6、 S2 and S1 group had the least haplotype amount, which both only have 1. The diversity of the haplotype (H1) of the 4 groups was between 0.4160.090 and 0.4160.090, plus the highest group was G1. The analysis result of AMOVE showed that the genetic difference that came from dissimilar groups (57.03%)

7、 was higher than which came from the same group (42.97%). The Fst values (the genetic differentiation of each group) were all positive, and the differentiation within the G2 group and others is the most. The result of the systematic revolution tree built by MEGA5.0 based on the genetic distance disc

8、overed that in the 4 groups of Litopenaeus Vannamei: S1 and S2 had the closest genetic distance of 0.017, so they gathered to be a branch; moreover, G2 and G1 gather to be branches respectively; whats more, the H1 was the shared haplotype in the 4 groups; furthermore, the G1 and G2 shared the H2 hap

9、lotype, whereas the SN and SF shared H11. Probably because of the overlap of their parents genetic background when breeding selection, while the G2 group was far from other groups in genetic distance, perhaps it was connected with the diversity of the geographic position of chosen group samples.Key

10、words ：Litopenaeus vannamei;Control-region gene sequence of mtDNA;Genetic Diversity;Haplotype 1 绪论：凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei),俗称南美白对虾,太平洋白对虾,原分布于南美太平洋沿岸水域1 ,为世界上公认的优良养殖对虾品种之一。近几年来,凡纳滨对虾出现群体遗传性状变异,优良性状丢失、品质下降、生长缓慢。为保护和充分利用优良种质,有效解决人工养殖过程中出现的病害流行、个体小型化、产量和质量下降等问题,我国每年都从美国引进良种亲虾。为了恢复和优化种质,有效解决人工养殖过程中出

11、现的病害流行、个体小型化、产量和质量下降 等问题,中国先后进行了多次原始种的引种。在这种情况下,有必要对引进品种的种质资源及引种后的人工繁殖、选择育种对群体遗传多样性水平的影响进行了解,为今后合理开发、保护和利用凡纳滨 对虾的种质资源以及遗传改良奠定基础。 日前凡纳纳滨对虾在世界范围的养殖已经非常广泛，研究其用于养殖及生态多样越来越丰富。目前关于凡纳滨对虾遗传多样性及其相关分析的成果多来自于以限制性片段多态性（RFLP），随机扩增多态性DNA（RAPD），序列特异性扩增区（SCAR），线粒体DNA标记(mtDNA)，扩增片段长度多态性（AFLP），简单序列重复（SSR），表达序列标签(EST)

12、，单核苷酸多态性（SNP）等分子标记分析技术为主的研究3-6，目前，生物线粒体DNA(mtDNA)已然成为研究动物系统天然进化和种群、种群遗传学的主要研究对象。通过分析、鉴定凡纳滨对虾mtDNA全序列或部分基因片段，全部分析结果其物种进化与遗传关系的已被广泛应用到南美白对虾的研究领域中,其中有关12S rRNA、16S rRNA、COI，D-loop等基因片段的研究较多7-11。凡纳滨对虾本身具有丰富的遗传多样性和遗传杂合水平12，而mtDNA具有独特的优点： DNA分子量小、单拷贝数高；结构和组织简单而高度保守；母系遗传，缺乏重组；DNA突变率高13-14。通过对凡纳滨对虾mtDNA控制区基

13、因序列多态性展开研究，可以有效了解群体的遗传结构、变异程度、基因流动及系统发育进化等方面的情况，更为探究线粒体DNA控制区作为一种基因条形码来识别不同群体的遗传关系是否有效提供理论依据15。本研究正是以此为基础，以凡纳滨对虾为研究对象，设计引物得到凡纳滨对虾线粒体DNA控制区序列，分析检测控制区DNA序列作为一种基因识别标记在凡纳滨对虾不同养殖群体多态性研究中的可行性，大多数作为凡纳滨对虾选育群体的遗传育种选优、种群测评和生物多样性提供有利的科学方法。2 材料与方法2.1研究样品来源及总DNA的提取本研究材料样本取自美国塞班岛凡纳滨对虾养殖基地(S1、S2群体)，美国关岛凡纳滨对虾养殖基地(G

14、1、G2群体)(表1)。实验样品成年虾100对每组，95%酒精密封于样本瓶中，带回实验室后于4冰箱保存备用。每群体随机挑选10尾取眼柄进行DNA的提取。 本研究使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技（上海）有限公司)提取凡纳滨对虾基因组总DNA。提取得到DNA样品经1.0% 的琼脂糖凝胶电泳检测纯度，紫外分光光度计测定浓度，保存于-20冰箱备用。2.2 mtDNA控制区基因序列的扩增及测序依据Genbank中已公布的凡纳滨对虾线粒体DNA全序列来设计引物，正向引物：F-82(5-TCAGTATAACCGCGGCTGCTGGCAC-3)；F-150(5-CATTTATTTA ATT

15、AGTACTA GGTACTGAG-3)；F-260(5-TTACATGTACCATTGACCTA AAAKTG-3)；F-276(5-CCTAA AAKTGAAAGAAYAAGCTAGG-3)。反向引物：R-822(5-CATTTAWARTTAATATAGAT AGAAT AATTG-3)；R-981(5-GATKTATWCTCTAGTATTTWTATGCTTAA-3)；R-1089(5-AGTGTCTTCT TTTTGTRTGA AACTT TAATC-3)；引物的合成通过生工生物工程（上海）股份有限公司合成完成的。将正反向引物两两交叉筛选，通过设置温度梯度(53，55，57，59，61)

16、进行引物pcr扩增。扩增产物经1.0% 的EB-琼脂糖凝胶电泳检测结果，最终确定正向引物F-276，反向引物R-1089组合于55扩增获得了稳定清晰的条带，可用于全部样品的扩增。PCR 反应体系为50L：DNA 模板 2.0 L；上、下游引物各 1 L；2PCR Master MIX25L（0.4mM dNTPs；0.1 U/L TaqDNA 聚合酶；2 Taq Buffer；3mM Mgcl2）；补充灭菌的去离子蒸馏水至总体积 50 L。PCR 反应条件为：94预变性 3 min ；94变性1min，55退火1min，72延伸 1min，35 个循环；最后72延伸5 min；4保存。扩增产物

17、用1.0%的EB-琼脂糖凝胶电泳检测后，直接送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。表1 凡纳滨对虾样品来源与养殖情况样品群体名称name样品来源source样品数量quantity养殖状态satutsS1塞班群岛10S1号养殖池S2塞班群岛10S2号养殖池G1关岛10G1号养殖池G2关岛10G2号养殖池2.3 线粒体控制区序列的整理与分析 将测序所获mtDNA序列用序列编辑软件Bioedit v7.0.5.2软件进行比对整理并辅以人工校对，去除两端多余序列后，用CLUSTL W软件进行多重比对分析，使用DNAsp v5计算变异位点和简约信息位点，并计算基因核苷酸多样性、单倍型多样性和平均

18、核苷酸差异数；用Arlequin 3.1软件计算统计碱基组成、多态位点数、转换、颠换和缺失等分子多态性指数，对4个群体遗传多样性进行Tajimas D 中性检验；对群体内和群体间的遗传变异进行AMOVA分子方差分析和遗传分化指数Fst检验。用SAMOVA软件计算最大分化指数来确定群体间的最大遗传分组。用MEGA 5.0软件中的Kimura Two-Parameter程序计算群体内和群体间遗传距离，用邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建基于遗传距离的群体间的分子系统树和单倍型基因类聚图，并对系统树各分支的支持率进行多次抽样检验。3 结果3.1凡纳滨对虾线粒体DNA测序结果 PCR

19、扩增得到凡纳滨对虾线粒体控制区DNA产物，采用pcr产物直接测序的方法，共计得到4个凡纳滨对虾群体，40个不同凡纳滨对虾个体的线粒体控制区DNA序列。使用Bioedit软件比对整理并人工校对后，序列平均有效长度603bp。将所测得序列通过BLASTn与NCBI中Genbank公布的凡纳滨对虾线粒体DNA序列比对分析，其同源相似性比例为87.0%，初步确认得到序列为凡纳滨对虾的线粒体控制区片段的目标序列。用于群体分析的线粒体控制区基因序列有效长度603bp，通过CLUSTL W软件进行多重比对分析，使用DNAsp v5计算变异位点和简约信息位点，其中基因保守位点503个，基因变异位点100个，简

20、约信息位点100个。主要变异位点集中在SN，SF两群体中。所有序列中的测得A、T、C、G的平均碱基含量分别为34.05%、48.51%、10.18%、7.26%，A+T的含量为82.56%，明显高于G+C的含量17.44%。3.2凡纳滨对虾单倍型及单倍型多样性在4个凡纳滨对虾群体，40个样本中共检测到15种单倍型，单倍型在4个群体的分布比例见表2，其中G-21 Da10，G11，G-11这4个单倍型样本较多。单倍型最多的群体为G1和G2均为6个，其次为S2(2个)，S1（1个），其中3个群体（S1、S2、G1）共享同一个单倍型G-21。4个凡纳滨对虾群体的单倍型多样性和核苷酸多态性分析结果显示

21、，单倍型多样性（Hd）为0.4160.0900.9730.022，核苷酸多样性（）为0.000690.000730.075090.03747。其中，遗传多样性最高的是群体SN(Hd= 0. 9730.022, =0.0670.033)，最低的是SD(Hd= 0.4160.090, =0.000690.00073)。对5个群体遗传多样性进行Tajimas D 中性检验(表3)，所有群体的Tajimas D中性检验范围为-1.066613.49478，群体SS(-0.96308)和GD（-1.06661）中性检验值为负值，但由于4个群体的中性检验结果均未达到显著水平(P0.05)，因此不支持这些群

22、体历史上经过群体扩增，符合中性突变。表2 线粒体控制区基因单倍型在4组凡纳滨对虾群体的分布单倍型Haplotype 群体名称name总个数（个）S1S2G1G2Da1066S-1111S-1211G-111G-311G-1155G-1311G-1411G-2113481G111G211G311G411G711G1155表3 4组凡纳滨对虾的遗传变异参数统计变异参数 Variability parameters群体名称 NameS1S2G1G2单倍型数1266单倍型多样性指数0.4160.00900.5930.1010.9730.0220.9660.022核苷酸多样性指数0.00690.0007

23、0.02500.01280.06700.03330.07510.0375平均核苷酸差异数0.41560.394815.07136.931840.371918.054145.276920.2799Tajimas D检验统计量0.89527-0.963082.992683.49478P值0.873000.177001.000001.000003.3凡纳滨对虾群体间的遗传分化与遗传距离利用mtDNA控制区序列比较4组凡纳滨对虾群体的遗传分化，根据软件Arlequin3.1的AMOVA分析结果表明：相同群体内的差异(48.66%)稍低于不同群体间的遗传差异（51.34%）。相同群体遗传趋向差异的FST

24、指数分析结果表明4个养殖群体之间很可能是存在遗传分化（Fst值均为正）。采用MEGA 5.0软件中的Kimura Two-Parameter程序计算群体间遗传距离(表4)，结果表明S1和S2群体之间的遗传关系最近，为0.024，S1和G2之间的遗传距离最远，为0.175。其中G2和S1，S2，G1，遗传距离均较远，推测可能与G2群体取样地理位置与其他群体较远有关。也有可能因为简单重复序列或微卫星具有变异性，并大量存在于基因组且以孟德尔方式遗传，共显性表达，推测可能与GD群体取样地理位置与其他群体较远有关。表4 4个凡纳滨对虾群体间遗传分化系数（对角线上）和群体间遗传距离（对角线下）群体名称Na

25、meS1S2G1G2S10.00100.330960.022030.88811S20.00100.00200.003553047900G10.0360014700.1450037655G20.01800.15000.15000.03303.4 基于mtDNA控制区序列的凡纳滨对虾分子系统树 分别根据遗传距离和单倍型构建群体之间的NJ系统进化树，从遗传距离NJ进化树（图1）可知，进化树主要分为2个分支：S1和S2遗传距离较近，聚为一支，其次与G1，G2聚为一支，这两支聚为一只相聚有一定距离。从单倍型进化树（图2）结果中得到：进化树主要分为两个大的分支，S1和S2共享单倍型Ga-21，两者的遗传关

26、系较近，G1、G2单倍型数目较多，除G2群体外，S1、S2、G1群体均存在独立单倍型。图1 基于线粒体控制区序列的遗传距离建立的5个凡纳滨群体之间的NJ类聚图AMOVA设计和结果变异来源自由度 平方和 方差组分 变异百分比(%) 种间3748.75024.55722va85.96种内36144.4004.0111vb14.04总数39893.15028.56833遗传分化指数FST：0.85960种群具体FST指数名称FST1S10.872702S20.872243G10.839374G20.85407群平均成对差异-对角线上方 : 种群之间的成对差异平均数（PIXY）对角线元素：种群内成对差

27、异平均数（PIX）对角线下面：修正平均配对差异（PiXY-（PIX+ PIY）/2）距离法：配对差异 1 2 3 4 1 0.53333 1.00000 79.90000 81.16000 2 0.33333 0.80000 78.98000 81.00000 3 69.84444 68.79111 19.57778 20.78000 4 75.30444 75.01111 5.40222 11.17778-PXY P value- 1 2 3 2 0.00909 3 0.00000 0.00000 4 0.00000 0.00000 0.00000-Corrected PXY P value

28、- 1 2 3 2 0.00909 3 0.00000 0.00000 4 0.00000 0.00000 0.00000图2 基于Kimura 双参数模型构建的线粒体控制区序列的单倍型NJ树 4 讨论4.1凡纳滨对虾种群遗传多样性本研究初步分析并比较了4组凡纳滨对虾不同群体的mtDNA控制区部分序列的差异，存在于真核细胞中的线粒体，通过线粒体控制区基因组是于核基因组的独立遗传的基因物质，然而生物体内的线粒体是具有高度自主性的细胞器，其内普遍含有DNA和转录和转译系统；并且线粒体DNA分子小、单拷贝序列数高；结构和组织简单而高度保守；母系遗传，缺乏重组；DNA突变率高13-14，加之凡纳滨对虾

29、本身具有丰富的遗传多样性，结果显示出了凡纳滨对虾具有较高的遗传杂合水平。线粒体DNA控制区基因序列在碱基组成上发现G 含量最低(7.26%)，AT 含量(82.56%)明显高于GC 含量(17.44%)，该结果与童金苟，单云晶等16-17的研究结果相似，也与线粒体控制区基因碱基组成中普遍存在的AT 含量高现象一致18。从原核生物到真核生物，其基因组中碱基使用偏向性的现象广泛存在，且不同物种间碱基的不均衡程度也各不相同19。这一现象的产生可能与基因的表达水平、翻译起始效应、碱基组分、基因长度以及密码子反密码子间结合能力的大小有关20。3.2凡纳滨对虾的遗传距离和遗传分化 单倍型结果表明，DNA

30、单倍型作为一种条形码标记能够区分多数不同群体(全部S1，S2，G1)，而少数群体不具有独特的单倍型(S1，S2，G1共享单倍型Ga-21)。这与单云晶等17研究结果有差异，推测可能是由于所选研究对象本身存在遗传杂合水平的不同所致。尽管很多生物研究取决于物种诊断，分类专业知识极近边缘。我们相信，唯一前景的一个可持续识别能力，在于对雇用DNA序列分类单元进行“条形码”系统建设。 遗传距离结果与单倍型结果类似，也同样显示S1、S2的遗传距离较近(0.017)，G2与其他4 个群体间的遗传距离均较远(0.1070.154)。产生这种结果的原因可能是这些品种在选育过程中是以经济性状为目标，几乎都是通过从

31、不同地区引进凡纳滨对虾群体之间的杂交选育而来，也可能与凡纳滨对虾本身的养殖地理位置差异有关21-23。4.3 线粒体DNA标记鉴别不同凡纳滨对虾养殖群体的可行性 众所周知，要作为标记条形码的基因序列，必须同时具备多个特征：首先是序列具有相对的保守性，便于通用引物扩增，得到想要并满意的产物；再者是具有遗传变异的多样性， 能够将物种和群体区别开来24。Hebert 等25认为，在动物界中，线粒体基因是合适的用于物种鉴定的DNA 条形码标准基因，因为动物mtDNA 的结构功能性简单、明显的家族母系遗传的特点进化稳定并快速、很少发成突变重组等特点，是物种间系统发育和物种进化常有用的基因。目前，线粒体基

32、因用于种间DNA 条形码的有效性已经得到广泛证明，并且随着BOLDSYSTEMS 数据库的产生，来自世界各个国家物种的DNA 条形码序列正在以每年300 万条的速度增加，该数据库使得种质鉴定的学术交流更加方便，并且提供一个更广阔的集成平台26。 线粒体DNA控制区用于种内不同群体间的鉴定，目前报道相对较少27-28，本研究目的在于探究线粒体DNA 控制区应用于不同群体间的鉴定是否有效，结果表明，线粒体DNA 控制区对于种内不同群体间的种质鉴定可行，但是仍有一定局限性。但可以肯定的是，基于mtDNA序列分析技术的分子标记，是一种实际可行和快速简便的物种群体鉴别方法，代表了未来物种鉴别研究的发展趋

33、势。随着对凡纳滨对虾线粒体序列不同标记基因研究的深入，将更能够准确地探讨凡纳滨对虾及其与其它对虾种间的系统进化关系，这些都对凡纳滨对虾生物多样性资源保护及研究提供了新的方向和科学材料。5 结论 本研究是承上启下的工作，为正确良好的构建凡纳滨对虾家系遗传育种的良好基础，又为凡纳滨对虾生物多向性提供有利序列。为提高南美白对虾的养殖选优，本实验从他的保守序列线粒体控制区去开始做起，而线粒体控制区既稳定又突变明显易于检测和对照，选用四种种群，两大家系。为不影响本实验的准确性和精确性，在进行重要环节核苷酸检测，pcr扩增，序列比对等环节均进行了不同程度的多次重复实验和不同软件进行实验，但难免不了实验过程

34、中的出现误差以及数据不理想情况，但都一一进行处理核实，为把实验误差降低到最低，不排除序列本身的突变等多态性结果。 放眼当今世界凡纳滨对虾选优育种科技方法,在改良凡纳滨对虾的遗传性状、预防病毒性侵害、培育遗传性状稳定的优良品种、增强免疫反应增长抗药性和耐受性的复杂过程中, 为了了解以上特征，并提高对虾育种计划的遗传改良的速度，决定这些特征的遗传位点首先需要通过连锁反应和数量性状基因座作图而被识别。为了增加进行映射的多态性标记数目，与含有一个或多个具有多个个或更多的重复的基序的微卫星侧接的引物组被设计并测试。常常是多层次多领域的学科知识和多方位多角度的现代科学技术,采用新技术与常规择优育种相辅相承

35、的,我们努力将科研成果应用到实际生活中，实现凡纳滨对虾研究育种的飞跃式发展。参考文献1杨彦豪,陈晓汉,谢达祥等.分子标记技术在凡纳滨对虾中的应用进展J.广西水产科技,2008,12（25):17-24.2梁宏伟, 邹桂伟, 罗相忠, 等. 3 种中国鲤mtDNA D-Loop序列的多态性与系统进化研究J. 西北农林科技大学学报: 自然科学版, 2009(3): 5559.3李锋,刘楚吾,林继辉.两个凡纳滨对虾亲本群体的RAPD研究J.湛江海洋大学学报,2003,23 (4):1-5.4沈琪,任春华,胡超群,等.凡纳对虾、细角对虾和斑节对虾的RAPD标记研究J.热带海洋学报,2002,21(4)

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