最新2016高中生物_5.3_血红蛋白的提取和分离课件_新人教版选修1

1、2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 课题课题3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 课标领航课标领航 1概述凝胶色谱法、电泳法等分离大分子概述凝胶色谱法、电泳法等分离大分子 的基本原理。的基本原理。 2能根据凝胶色谱过程中的现象和结果，能根据凝胶色谱过程中的现象和结果， 评价实验操作的过程是否规范，分析实验结评价实验操作的过程是否规范，分析实验结 果。果。 3尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，尝试对血液中血红蛋白的提取和分离， 体验从复杂的体系中提取生物大分子的基本体验从复杂的体系中提

2、取生物大分子的基本 过程和方法。过程和方法。 【重点】【重点】凝胶色谱法、电泳法基本原理。凝胶色谱法、电泳法基本原理。 【难点】【难点】实验操作的过程及分析。实验操作的过程及分析。 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 情境导引情境导引 为年老多病的人注射丙种为年老多病的人注射丙种 球蛋白，可以在一定程度上增强球蛋白，可以在一定程度上增强 其身体的抵抗力。在动物体内，其身体的抵抗力。在动物体内， 丙种球蛋白和许多蛋白质混合丙种球蛋白和许多蛋白质混合 在一起在一起。要获得纯净的丙种球蛋。要获得纯净的丙种球蛋 白制品，就必须进行白制品，就必须进行提取和分离提取和分离

3、。 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差 异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分 子产生不同的迁移速度，从而实现了样品中各种子产生不同的迁移速度，从而实现了样品中各种 分子的分离。分子的分离。 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，的差异， 如如分子的形状和大小、所带电荷分子的形状和大小、所带电荷 的性质和多少、溶解度、吸附性的性质和多少、溶解度、吸附性 质和对其他分子的亲和力质和对其他分子的亲和力等等，等等， 可以用来分离可

4、以用来分离不同种类不同种类的蛋白质。的蛋白质。 一、基础知识一、基础知识 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如（如葡聚糖葡聚糖 或琼脂糖或琼脂糖）构成的）构成的多孔多孔小球体，小球体，内部有许多贯内部有许多贯 穿的穿的通道通道。 根据被分离物质的蛋白质根据被分离物质的蛋白质相对分子质量相对分子质量 的大小的大小，利用具有，利用具有网状结构网状结构的凝胶，来进行的凝胶，来进行 分离。分离。 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，洗脱：从色谱柱

5、上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。促使蛋白质分子的差速流动。 混合物混合物 上上 柱柱 洗洗 脱脱 大分子流动快大分子流动快 小分子流动慢小分子流动慢 收收 集集 大分子大分子 收收 集集 小分子小分子 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中 的进行过程可表示为图中哪一个的进行过程可表示为图中哪一个 B 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 3、原理：、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相当不同的蛋白质通过凝胶时，相 对（对（ ）的蛋白质容易进入）的蛋白质

6、容易进入 凝胶内部的通道，路程（凝胶内部的通道，路程（ ），移动速），移动速 度（度（ ），而（），而（ ） 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能 在（在（ ）移动，路程（）移动，路程（ ），）， 移动速度（移动速度（ ），相对分子质量不同），相对分子质量不同 的蛋白质因此得以分离。的蛋白质因此得以分离。 相对分子质量较小相对分子质量较小 较长较长 较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大 凝胶外部凝胶外部较短较短 较快较快 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢

7、小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 思考：所有的蛋白质都可以用凝胶色谱法思考：所有的蛋白质都可以用凝胶色谱法 来分离吗？来分离吗？ 进行体外实验时，如何保证蛋白质不会发生变性呢？进行体外实验时，如何保证蛋白质不会发生变性呢？ 不是，能分离的蛋白质分子必须是具有相不是，能分离的蛋白质分子必须是具有相 对分子质量不同的蛋白质对分子质量不同的蛋白质。 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 1、概念：在一定的范围内，能对抗、概念：在一定的范围内，能对抗 外来少量强酸、强碱外来少量强酸、强碱或

8、稍加稀释不引起或稍加稀释不引起 溶液溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作发生明显变化的作用叫做缓冲作 用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 2、作用：、作用： 能够抵制（能够抵制（ ）对溶液的）对溶液的 （ ）的影响，维持）的影响，维持PH基本不变。基本不变。 外界的酸或碱外界的酸或碱 PH值值 （二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制 通常由（通常由（ ）种缓冲剂溶解于水）种缓冲剂溶解于水 中配制而成。调节缓冲剂的（中配制而成。调节缓冲剂的（ ） 就可以制得（就可

9、以制得（ ）使用的）使用的 缓冲液。缓冲液。 12 使用比例使用比例 在不同在不同PH范围内范围内 思考：说出人体血液中缓冲对？思考：说出人体血液中缓冲对？ NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO3 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲 液是什么？它的目的是什么？液是什么？它的目的是什么？ 使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲 液模拟细胞内的液模拟细胞内的PH环境，环境，保证血红蛋白保证血红蛋白 的正常结构和功能，便于观察（红色）的正

10、常结构和功能，便于观察（红色） 和材料的科学研究（活性）和材料的科学研究（活性） 如何证明凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？如何证明凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？ 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 带电粒子在带电粒子在 作用下发生作用下发生 的过程。的过程。 许多重要的生物大分子，如多肽、核许多重要的生物大分子，如多肽、核 酸等都具有酸等都具有 的基团，在一定的的基团，在一定的PHPH下，下， 这些基团会带上这些基团会带上 或或 。在电场的作在电场的作 用下，这些带电分子会向着的用下，这些带电分子会向着的 的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分的电极移

11、动。电泳利用了待分离样品中各种分 子子 以及分子本身的以及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的的不同，使带电分子产生不同的 ， 从而实现样品中各种分子的分离。从而实现样品中各种分子的分离。 琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。 电场电场迁移迁移 可解离可解离 正电正电 负电负电 与其所带电荷相反与其所带电荷相反 带电性质的差异带电性质的差异大小大小 形状形状 迁移速度迁移速度 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。 2016高中生物_5.3_血红蛋

12、白的提 取和分离课件_新人教版选修1 影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 在测定蛋白质分子量时常用在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠 （SDSSDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 是由单体丙烯酰胺和交联剂是由单体丙烯酰胺和交联剂N,NN,N- -亚甲基双丙烯亚甲基双丙烯 酰胺在酰胺在引发剂引发剂和和催化剂催化剂的作用下聚合交联成的具的作用下聚合交联成的具 有三维网状结构的凝胶。有三维网状结构的凝胶。 N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）亚甲基双丙

13、烯酰胺（形成交联） 丙烯酰胺和交联剂丙烯酰胺和交联剂 N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决 于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。 。由几条肽链组成。由几条肽链组成 的蛋白质复合体在的蛋白质复合体在SDSSDS的作用下会的作用下会， 因此测定的结果只是因此测定的结果只是。SDSSDS能与各能与各 种蛋白质形成种蛋白质形成，SDSSDS所带负电荷所带负电荷 的量大大超过了蛋白质

14、分子的量大大超过了蛋白质分子。因而掩。因而掩 盖了盖了，使，使电泳迁移率完电泳迁移率完 全取决于分子的大小全取决于分子的大小。 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 用用SDS SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质 分子量的方法分子量的方法 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先 处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。 测定蛋白质的相对分子

15、质量常用测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳， 这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所 带电荷的性质和分子的大小、形状。带电荷的性质和分子的大小、形状。 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 二、实验操作二、实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步： 样品处理样品处理粗分离（透析）粗分离（透析）纯化纯化纯度鉴定（电泳）纯度鉴定（电泳） 2016高中生物_5.3

16、_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 二、实验操作：二、实验操作： 知识回顾知识回顾 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 每个肽链环绕（每个肽链环绕（ ），）， 此基团可携带（此基团可携带（ ）。）。 血红蛋白因含有（血红蛋白因含有（ ）而呈红色。本课题可选用）而呈红色。本课题可选用 猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。 一个亚铁血红素基团一个亚铁血红素基团 一分子氧或一分子二氧化碳一分子氧或一分子二氧化碳 血红素血红素 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 201

17、6高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 采集得到血液（加入抗凝血剂采集得到血液（加入抗凝血剂柠檬酸钠柠檬酸钠） （二）操作过程（二）操作过程 防止血液凝固防止血液凝固 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 1、样品的处理 （1）红细胞的洗涤 A、洗涤目的: B、分离时采用 离心，用 洗 涤，重复洗涤 ，直至 为什么要低速短时离心？ 防止白细胞沉淀（P69） C、能否用蒸馏水代替生理盐水？ 去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化 低速短时间低速短时间五倍体积的生理盐水五倍体积的生理盐水 三次三次 上清液不再

18、呈现黄色，上清液不再呈现黄色， 表明红细胞已洗涤干净表明红细胞已洗涤干净 不能，不能，生理盐水能保持红细胞的渗透压生理盐水能保持红细胞的渗透压而不至于破裂，而不至于破裂，若红细胞若红细胞 提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大分离难度。，加大分离难度。 D、为什么要缓慢搅拌？、为什么要缓慢搅拌？ 防止红细胞破裂释放出血红蛋白。防止红细胞破裂释放出血红蛋白。 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 洗涤过程图解：洗涤过程图解： 血液血液 100mL 3g柠檬酸钠柠檬酸钠 低速离心低速离心 2 min 红细胞红细胞

19、血血 浆浆 吸出血浆吸出血浆 红细胞红细胞 5倍体积生理盐水倍体积生理盐水 搅拌搅拌10min 重复洗涤重复洗涤3 3次，直至上清液没有黄色次，直至上清液没有黄色 再加入再加入用（用（ ）的（）的（ ） 质量分数为质量分数为0.9 的氯化钠溶液洗涤的氯化钠溶液洗涤,缓慢搅拌缓慢搅拌10MIN，（ ）离心离心. 五倍体积五倍体积 如此重复洗涤（如此重复洗涤（ ）次，直至上清液中已没有）次，直至上清液中已没有 （ ），表明洗涤干净），表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离利于后续血红蛋白的分离 纯化，不可洗涤次数过少。纯化，不可洗涤次数过少。 三 黄色黄色 生理盐水生理盐水 低速短时间低速短时间 2

20、016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 初次离心后的结果3次洗涤后的结果 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 加蒸馏水到加蒸馏水到原血液体积原血液体积，再加再加4040 体积的体积的甲苯甲苯 ，置于置于磁力搅拌器磁力搅拌器上充分搅拌上充分搅拌1010分钟分钟 （加速细胞破裂加速细胞破裂）, ,细胞破裂释放出细胞破裂释放出血红蛋白。血红蛋白。 将搅拌好混合液转移到离 心管内，以2000r/min的速度离心10 min。第1层（最上 层）：甲苯层（无色透明）；第2层 （中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色 薄层固体）；第3层（中下层）：血红

21、 蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第 4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红 色）。用滤纸过滤，除去脂溶 性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后， 分出下层的红色透明液体。 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 （2）释放血红蛋白）释放血红蛋白 思考：思考： 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了 哪些物质？哪些物质？ 为了加速释放过程，采取了什么措施？为了加速释放过程，采取了什么措施？ （使用磁力搅拌器充分搅拌）（使用磁力搅拌器充分搅拌） 目的分析：目的分析： 蒸馏水的作用是蒸馏水的作用是_。 加入甲苯的作用是加入甲苯的作用是

22、_。 1. 充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_。 使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂 （蒸馏水，（蒸馏水，40%体积的甲苯）体积的甲苯） 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 磁力搅拌器 搅拌器转子搅拌器转子 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 搅拌器正在工作 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 3.分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液： 将搅拌好的混合溶液转移到离心管中，以将搅拌好的混合溶液转移到离心管中，以 2000

23、r/mim的速度离心的速度离心10mim后，可以看后，可以看 出溶液分为出溶液分为4层，从上往下数，第一层是无层，从上往下数，第一层是无 色透明的甲苯层，第二层为白色薄层固体，色透明的甲苯层，第二层为白色薄层固体， 是脂溶性物质沉淀层，第三层为红色透明是脂溶性物质沉淀层，第三层为红色透明 液体，这是血红蛋白的水溶液，第四层是液体，这是血红蛋白的水溶液，第四层是 其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液 体用体用滤纸滤纸过滤，除去过滤，除去脂溶性沉淀物脂溶性沉淀物，于，于分分 液漏斗液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透中静置片刻后，分出下层的红色透 明液体明液体

24、2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 第第1层：（层：（ ）甲苯层）甲苯层 第第2层：层：（ ）色薄层固体）色薄层固体 （ ）的沉淀层，的沉淀层， 第第3层层: （ ）的液体）的液体 （ ）的水溶液层的水溶液层 第第4层层:其它杂质（其它杂质（ ）的沉淀层）的沉淀层 无色透明无色透明 脂溶性物质脂溶性物质 白白 血红蛋白血红蛋白 红色透明红色透明 暗红色暗红色 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 用用 过滤过滤 ，除，除 去去 ， 于分液漏斗中静置片于分液漏斗中静置片 刻后，刻后，分出下层的红分出下层的红 色透明液体色透明液体。

25、 滤纸滤纸 脂溶性沉淀层脂溶性沉淀层 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 .分离血红蛋白分离血红蛋白 分离过程分离过程: 红细胞红细胞 混合液混合液 高速离心高速离心 10min 离心管离心管 滤纸滤纸 过滤过滤 脂类物质脂类物质 烧杯烧杯 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 2.粗分离-透析（去除分子量较小的杂质） （1）用 方法进行粗分离，透析袋由半透膜制 成， 常用 。将透析袋放入 溶液中进行透析。 （2）透析的原理是 （3）透析的目的是 。 透析透析 玻璃纸、肠衣、膀胱膜玻璃纸、肠衣、膀胱膜 透析袋能使小分子自由进出，

26、而将透析袋能使小分子自由进出，而将 大分子保留在袋内大分子保留在袋内 去除样品中分子量较小的杂质去除样品中分子量较小的杂质 磷酸缓冲磷酸缓冲 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 取取( )ml的血红蛋白溶液装入（的血红蛋白溶液装入（ ）中，）中， 将透析袋放入盛有将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度的物质的量浓度 为为20mmol/L的（的（ ）中，）中，pH为为 （ ），透析），透析12小时，目的是小时，目的是 （ ）或用）或用 于更换样品中的（于更换样品中的（ ）。）。 除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质 透析袋透析袋 磷酸缓冲液磷酸

27、缓冲液 7.0 缓冲液缓冲液 4. 透析透析（粗分离）（粗分离） 1 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 透析过程中如何去除无机盐离子和小分子有透析过程中如何去除无机盐离子和小分子有 机物？机物？ 半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过 半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。在半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。在 透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分 子不断通过半透膜扩散进入到子不断通过半透膜扩散进入到pH7的磷酸的磷酸 缓冲液中。缓冲液中。 透析过程中为何使用透析过程中为何使用pH

28、7的磷酸缓冲液？的磷酸缓冲液？ 为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？ 维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子 充分地向外扩散。充分地向外扩散。 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 （一）样品处理（一）样品处理 1 1、红细胞的洗涤：、红细胞的洗涤： 2 2、血红蛋白的释放：、血红蛋白的释放： 3 3、分离血红蛋白溶液：、分离血红蛋白溶液： 4 4、透析、透析：（：（如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？）如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？） 血液柠檬酸钠血液柠檬酸钠低速短时离心低速短时离

29、心吸出上层血浆吸出上层血浆红细胞红细胞5倍倍 体积生理盐水体积生理盐水 缓慢搅拌缓慢搅拌10min低速短时离心低速短时离心吸出上清液吸出上清液 反复洗涤直至上清液无黄色反复洗涤直至上清液无黄色 在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放 红细胞破碎混合液红细胞破碎混合液中速长时离心（中速长时离心（2000c/min10min） 滤纸过滤除去脂质滤纸过滤除去脂质分液漏斗分离出血红蛋白，分液漏斗分离出血红蛋白，得到红色透明得到红色透明 液体。液体。 装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为为7.0）透析。）透析。 二、实验操作：二

30、、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 （二（二).凝胶色谱操作凝胶色谱操作- 1.凝胶色谱柱的制作：凝胶色谱柱的制作： 2.凝胶色谱柱的装填：凝胶色谱柱的装填： 教材图教材图519 3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱 血红蛋白的纯化血红蛋白的纯化 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨两端需用砂纸磨 平。平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移

31、液管头部覆覆 盖尼龙网，再用盖尼龙网，再用100100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。 ：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底 面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离 不彻底。不彻底。顶塞的制作：顶塞的制作：打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管。组装：。组装：将上将上 述三者按相应位置组装成一个整体述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。安装其他附属结构。 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 装配好的凝胶柱

32、2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 A A、材料：、材料：交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（G-75G-75）。）。 配置凝胶悬浮液：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定计算并称取一定 量的凝胶浸泡于量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液蒸馏水或洗脱液中充分中充分溶胀溶胀后，配成后，配成 凝胶悬浮液凝胶悬浮液。 A A、固定：、固定：将色谱柱装置固定在支架上。将色谱柱装置固定在支架上。 B B、装填：、装填：将凝胶悬浮液将凝胶悬浮液一次性一次性缓慢倒入色谱柱缓慢倒入色谱柱 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 注意：注意：1 1、

33、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之 间的空隙。间的空隙。 2 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为因为 气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效 果果。 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 装填完毕后，装填完毕后， 立即用缓冲液洗脱瓶，在立即用缓冲液洗脱瓶，在 50cm50cm高的操作压高的操作压下，用下，用300ml300ml 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液 （pHpH为为7.07.0）充分洗涤平衡）充分洗涤

34、平衡1212 小时。小时。1 1、液面不要低、液面不要低 于凝胶表面，否则于凝胶表面，否则可能有气可能有气 泡混入泡混入，影响液体在柱内的，影响液体在柱内的 流动与最终生物大分子物质流动与最终生物大分子物质 的分离效果。的分离效果。2 2、不能发生洗、不能发生洗 脱液流干，露出凝胶颗粒的脱液流干，露出凝胶颗粒的 现象现象。 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 打开下端出口，使柱内打开下端出口，使柱内 缓冲液缓慢下降到与缓冲液缓慢下降到与凝胶面凝胶面平齐，关闭出口。平齐，关闭出口。 吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱样品加到色谱 柱的顶端，滴加样品时，吸管管口

35、贴着管壁环柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环 绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 正确的加样操作是：正确的加样操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。 2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 加样后加样后打开下端出口打开下端出口， 使样品渗入凝胶床内，等样品使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶完全进入凝胶 层后，关闭下端出口层后，关闭下

36、端出口 小心加入小心加入pH=7.0 的的20mmol/l的磷的磷 酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶， 打开下端出口进行洗脱。打开下端出口进行洗脱。 待红色的蛋白质接近色谱柱底端待红色的蛋白质接近色谱柱底端 时，用试管收集流出液，每时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，收集一试管， 连续收集。（在分离过程中，如果红色区带连续收集。（在分离过程中，如果红色区带 均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 教材教材P70：为什么凝胶的装填要紧密、为什么凝

37、胶的装填要紧密、 均匀？均匀？ 如果装填如果装填不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形 成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品 分子从这些空隙中通过分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液中蛋白，搅乱洗脱液中蛋白 质的洗脱次序，影响分离的效果。质的洗脱次序，影响分离的效果。 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 (3)样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱 调整缓冲液面：与凝胶面平齐调整缓冲液面：与凝胶面平齐 滴加透析样品：用量为滴加透析样品：用量为1 mL 样品渗入凝胶床：样品完全渗进凝胶层样品渗入凝胶床：样品

38、完全渗进凝胶层 洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱 收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用 试管收集流出液，每试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集收集一管，连续收集 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 (3(3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱 加样前加样前 打开下端出口，使柱内凝打开下端出口，使柱内凝 胶面上的（胶面上的（ ）缓慢下）缓慢下 降到与（降到与（ ）平齐，）平齐， 关闭出口关闭出口 缓冲液缓冲液 凝胶面凝胶面 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件

39、_新人教版选修1 正确的加样操作是：正确的加样操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。 2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。 加透析样品加透析样品 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 调整缓冲液面：与凝胶面平齐调整缓冲液面：与凝胶面平齐 滴

40、加透析样品：加到色谱柱的（滴加透析样品：加到色谱柱的（ ） 样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：（ ） 再调整缓冲液面洗脱：再调整缓冲液面洗脱： 收集：收集：待（待（ ）接近色谱柱底接近色谱柱底 端时收集端时收集 顶端顶端 样品完全进凝胶层样品完全进凝胶层 红色的蛋白质红色的蛋白质 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 收集得到的纯化后的蛋白 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 4、纯度鉴定（电泳）、纯度鉴定（电泳）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、垂直板电泳装置、垂直板电泳装置 2、稳流稳压电泳仪；、稳流稳压电泳仪；

41、 3、微量进样器（可用微量移液器代替）、微量进样器（可用微量移液器代替） 判断（判断（ ）的蛋白质是否达到要求，）的蛋白质是否达到要求， 需要进行蛋白质的需要进行蛋白质的鉴定鉴定。 纯化纯化 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 （5）装槽、点样：）装槽、点样： 拔出梳子拔出梳子 将胶板固定在电泳槽上（凹板将胶板固定在电泳槽上（凹板 一侧向内）一侧向内） 在电泳槽中加入缓冲液在电泳槽中加入缓冲液 点样。点样。 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 （6）电泳：）

42、电泳： 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 （7)、剥胶、染色及脱色、剥胶、染色及脱色 凝胶板剥离：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板剥离：电泳结束后，撬开玻璃板，将 凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加染色液染凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加染色液染 色，然后用脱色液脱色。色，然后用脱色液脱色。 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 (8)、结果、结果 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-5- 181

43、8），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋 白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋 巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白 的提取纯度。的提取纯度。 1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处 理后的样品发生了哪些变化吗？理后的样品发生了哪些变化吗？ 2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱

44、柱装填得成功吗？你是如何判断的？柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支 与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可 以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，或红色葡聚糖， 观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色 谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体谱柱的性能良好。如果色

45、谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体 以消除气泡，消除不了时要重新装柱。以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确 的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、 平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散 乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的 装填有关。装填有关。 2016高中生物_5.3_血红

46、蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 五、操作提示五、操作提示 1红细胞的洗涤：洗涤次数、红细胞的洗涤：洗涤次数、_与离心时与离心时 间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白：间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白： 离心速度过高和时间过长会使离心速度过高和时间过长会使_等一同沉淀，等一同沉淀， 达不到分离效果。达不到分离效果。 离心速度离心速度 白细胞白细胞 2色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接 放在洗脱液中膨胀，可以将加入其中的湿凝胶用放在洗脱液中膨胀，可以将加入其中的湿凝胶用 _加热，加速膨胀。加热，加速膨胀。 3凝胶色谱柱的装填：在装填

47、凝胶柱时，不得凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得 有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱 次序，降低分离效果。次序，降低分离效果。 4蛋白质的分离：如果红色区带蛋白质的分离：如果红色区带_地地 移动，说明色谱柱制作成功。移动，说明色谱柱制作成功。 沸水浴沸水浴 均匀一致均匀一致 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 (1)在加样示意图中，在加样示意图中， 正确的加样顺序是正确的加样顺序是_。 (2)用吸管加样时，应注意正确操用吸管加样时，应注意正确操 作，分别是作，分别是_、 贴着管壁加样、贴着管壁加样、_。 (

48、3)等样品等样品_时，才加入缓冲液，待时，才加入缓冲液，待 _接近色谱柱底端时，用试接近色谱柱底端时，用试 管收集流出液，每管收集流出液，每_mL收集一管，连收集一管，连 续收集。续收集。 【尝试解答】【尝试解答】(1) (2)不要破坏凝胶面使吸管管口沿管壁环绕移动不要破坏凝胶面使吸管管口沿管壁环绕移动 (3)完全进入凝胶层红色的蛋白质完全进入凝胶层红色的蛋白质5 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 【探规寻律】【探规寻律】对分离效果的判断对分离效果的判断 (1)若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随 洗脱液缓慢流出，

49、则装填成功，分离操作正确。洗脱液缓慢流出，则装填成功，分离操作正确。 (2)若血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则若血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则 说明分离效果不好，装填不成功。说明分离效果不好，装填不成功。 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 【互动探究】【互动探究】(1)凝胶色谱柱的装填应注意哪些凝胶色谱柱的装填应注意哪些 事项？事项？ (2)血红蛋白溶液是如何分离的？血红蛋白溶液是如何分离的？ 【提示】【提示】(1)装填前为了加速膨胀，可以加入装填前为了加速膨胀，可以加入 洗脱液的湿凝胶，用沸水浴加热，优点是：节约洗脱液的湿凝胶，用沸水浴加热，

50、优点是：节约 时间，除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒时间，除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒 内的空气。内的空气。 装填时不能有气泡，气泡会搅乱洗脱液中蛋白装填时不能有气泡，气泡会搅乱洗脱液中蛋白 质的洗脱次序，降低分离效果。质的洗脱次序，降低分离效果。 装填后不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现装填后不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现 象。象。 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱 分离时可以通过观察颜色来判断什么时分离时可以通过观察颜色来判断什么时 候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分候

51、应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分 离过程非常直观，大大简化了实验操作。离过程非常直观，大大简化了实验操作。 思考思考 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步， 包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离 心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处 理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即 （ ）；然后通过凝

52、胶色谱法）；然后通过凝胶色谱法 将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品 的（的（ ）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进 行（行（ ）。）。 思考思考 样品的粗分离样品的粗分离 纯化纯化 纯度鉴定纯度鉴定 2016高中生物_5.3_血红蛋白的提 取和分离课件_新人教版选修1 3.SDS3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红鉴定血红 蛋白纯度蛋白纯度 （1 1）试剂的配制）试剂的配制 丙烯酰胺和丙烯酰胺和N, N-N, N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺 用去离用去离 子水配制子水配制29%29%（29 g/100 mL29 g/100 mL，下同）的丙烯酰，下同）的丙烯酰 胺和胺和1%1%的的N, N-N, N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液甲叉双丙烯酰胺的贮存液 十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS） 用去