溶解曲线[应用材料]_第1页
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文档简介

1、DNA溶解曲线表示扩增产物的特异性。曲线横坐标是温度，每个温度点一个。一般从60到98度纵坐标是荧光强度的变化值（不是强度本身）。一开始加热的时候，虽然荧光强度比较强，但是由于双链没有解离，所以荧光强度保持不变。当加热接近于PCR产物Tm时，双链开始解离，荧光强度变小，机器会比较前后2个温度点的荧光强度，然后把2者的差值标在图上。Tm到达时，有一般双链解离，这时的荧光强度变化最大（峰值）。再加热，双链全部解离，所以荧光强度的变化又变小了。 你PCR产物大小不一，但是只要有相同或者相近的Tm，峰值就有可能在一个位置上。如果实际测得的峰值和理论计算的吻合，问题不大。如果有差别，说明有非特异性产物，

2、建议不要再用SYBR GREEN方法。标准的PCR过程分为三步：1.DNA变性（90-96）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA2.退火（25-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3.延伸（70-75）：在Taq酶（在72左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。1、随着温度的升高，DNA双链断裂；接着温度降低，到达退火温度的时候，DNA双链复性，荧光分子绑定在DNA双链上，所以荧光信号值到达最高点。上面的是反映在扩增曲线上面的。如图所示，这就是一个标准的

3、real time-qPCR溶解曲线。下面从几个方面来解读：2、接着DNA双链分子由退火温度约60度，继续升温，双链断开，DNA分子溶解。请注意溶解曲线的纵坐标，表示单位时间内荧光信号的变化量。当扩增产物特异，是单一产物的时候，这个纵坐标峰值所对应的横坐标应该是一致的，即呈现单一的溶解峰，这个时候，在同样的温度下，可以认为是产物相同；如果溶解峰不单一，就意味有非特异性扩增。一般在荧光定量PCR中会用到扩增曲线.描述PCR动态进程的曲线即为扩增曲线,在进行PCR反应过程中,通过检测系统对PCR管内的样品进行实时检测,最后将荧光信号值通过成像技术显现在电脑上.正常的扩增曲线包括四个阶段：基线期,指数增长期,线性增长期,平台期.扩增曲线可以粗略地判断扩增效率。SYBR Green的双delta Ct法要求目的基因和内参的扩增效率基本一致。如果不一致，需要对公式进行修正，部分qPCR仪的配套软件可以做到，直接输入每对引物的扩增效率。但无论如何，保证高扩增效率是实验成功的关键。如果扩增效率一致，不同Ct的曲线显示出来就基本是平行的位移，其倾斜程度基本一致。而如下图一样，一条比较“陡”，另一条比较“平”，那么意味着扩增效率不一致。有可能

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