DNA重组酶切和连接课件

1、DNA重组酶切和连接1 Q sample 1; Lane3：sample 2; Lane4：sample 3 1 2 15000bp 10000bp 7500bp 5000bp 2500bp 1000bp 250bp 3 4 DNA重组酶切和连接5 我们的结果我们的结果 质优量少，成功率低质优量少，成功率低 质优量足质优量足 卫星菌落？卫星菌落？ DNA重组酶切和连接6 我们的结果我们的结果 ?电泳行为异常电泳行为异常? DNA重组酶切和连接7 我们的结果我们的结果 可用可用 电泳：尽量减少上样时间，减少扩散；电泳：尽量减少上样时间，减少扩散； 样品尽量均匀分布于胶孔中；样品尽量均匀分布于胶孔

2、中； 尽量远离边缘泳道尽量远离边缘泳道 DNA重组酶切和连接8 Q&A 关于实验中的安全问题关于实验中的安全问题 关于酚关于酚- -氯仿氯仿- -异戊醇异戊醇 分层问题：下层分层问题：下层 作用问题：酚变性蛋白作用问题：酚变性蛋白 氯仿去除脂类，除酚氯仿去除脂类，除酚 异戊醇消泡，减少表面张力剪切异戊醇消泡，减少表面张力剪切 关于酚：关于酚：下层；下层； 氧化判断氧化判断 DNA重组酶切和连接9 基因重组基因重组 酶切和连接酶切和连接 DNA重组酶切和连接10 DNA重组酶切和连接11 剪切剪切 5NNGOH pGATCCNN3 3NNCCTAGp HOGNN5 BamH Hind + DNA

3、重组酶切和连接12 引物引物1 1 5GTCGCGGATCCGATGTCACGGCCGAGAC 3 CDS CDS 5AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT . AKP CDS . . . CDSCDS .CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3 引物引物2 2 3GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAGCG 5 BamH1 Hind pETBlue-2 ATG GCG ATA TCC CGG GAG CTC GTG GAT CCG AAT 引物引物1 1： 5GTCGCGGATCCGATGTCACG

4、GCCGAGAC3 BamH 引物引物2 2： 5GCGACAAGCTTTATTTCAGCCCCAGAGC3 Hind DNA重组酶切和连接13 5pApCpGoH pApApTpTpCpGpT3 3TpGpCpTpTpApAp oHG pCpAp5 5pApCpGpApApTpTpCpGpT3 3TpGpCpTpTpApApGpCpAp5 Mg2+ ATP T4DNA连接酶连接酶 连接连接 DNA重组酶切和连接14 pETBlue-2 3.653kb 酶酶 切切 连连 接接 酶酶 切切 pETBlue - AKP (5.2kb) pETBlue-2 3.653kb 转化转化 复苏复苏 pET

5、Blue- AKP AKP pETBlue-pETBlue AKPAKP DNA重组酶切和连接15 u 酶切：酶切：37370 0C C，水浴酶切，水浴酶切3 3小时小时( (封口膜封口）封口膜封口） u 酶切产物的纯化和盒回收：酶切产物的纯化和盒回收： 直接进行液体回收：直接进行液体回收： 每每100uL100uL溶液加入溶液加入500uL500uL溶胶液，其余的操作步骤同前。溶胶液，其余的操作步骤同前。 向柱子的向柱子的正中央正中央 共共加加20uL20uL洗脱洗脱bufferbuffer，其余步骤同前。其余步骤同前。 酶酶 切切 反反 应应 体体 系系 管号管号核酸核酸10 xbuffe

6、rK10 xbufferKddHddH2 2O OBamHIBamHIHandIIIHandIII tube1tube1 目的基因目的基因 AKP AKP 24 uL24 uL 3 uL3 uL0 uL0 uL2 uL2 uL1 uL1 uL tube2tube2 pETBlue-2 pETBlue-2 10 uL10 uL 2 uL2 uL5 uL5 uL2 uL2 uL1 uL1 uL 实验操作酶切实验操作酶切 每人做一至两份每人做一至两份 DNA重组酶切和连接16 胶回收原理胶回收原理 硅基质材料：硅基质材料： 小片段双链小片段双链DNADNA高盐环境与其吸附高盐环境与其吸附 低盐环境与

7、其解离低盐环境与其解离 DNA重组酶切和连接17 每每100uL100uL溶液加入溶液加入500uL500uL溶胶液溶胶液, ,混匀。混匀。 将液体转移至吸附柱，将液体转移至吸附柱，12000rpm12000rpm离心离心3030秒，去除废液秒，去除废液 漂洗漂洗: :向吸附柱的向吸附柱的正中央正中央加入加入500uL500uL漂洗液，漂洗液，12000rpm12000rpm离心离心3030秒，秒， 去除废液。去除废液。重复一次。重复一次。 空柱空柱12000rpm12000rpm离心离心2min2min，以彻底去除废液，以彻底去除废液 将吸附柱置于一新的干净将吸附柱置于一新的干净无菌的无菌的

8、1.5mLEP1.5mLEP管中，向吸附柱的管中，向吸附柱的正正 中央中央加加15uL15uL无菌水，室温放置无菌水，室温放置5 5分钟。分钟。12000rpm12000rpm离心离心3030秒，以秒，以 洗脱洗脱DNADNA。 再次向柱子的再次向柱子的正中央正中央加加5uL5uL无菌水，室温放置无菌水，室温放置5 5分钟；分钟；12000rpm12000rpm 离心离心2 2分钟。分钟。合并回收液合并回收液。 SYBRSYBR检测回收产物检测回收产物 避免乙醇对避免乙醇对 酶促反应的酶促反应的 影响影响 DNA重组酶切和连接18 1%1%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 25mL (25mL (用用1x

9、TAE1xTAE配配) 1uL GoldView) 1uL GoldView 样品：酶切样品：酶切DNA 4uL + 0.5uL 10 xloadingDNA 4uL + 0.5uL 10 xloading 质粒对照：未酶切质粒质粒对照：未酶切质粒DNA 2uL DNA 2uL + 0.5uL 10 xloading0.5uL 10 xloading 分子量分子量MarkerMarker： 5uL5uL 8080伏恒压电泳，结果凝胶成像分析伏恒压电泳，结果凝胶成像分析 注意：注意： MarkerMarker上上5uL5uL时大概的量是时大概的量是50ng/50ng/条带条带 上样上样精准精准

10、1)1)上样顺序（对照）上样顺序（对照） 实验操作酶切电泳分析实验操作酶切电泳分析 P V0 V1 V1 M DNA重组酶切和连接19 连连 接接 反反 应应 体体 系（系（ 20 uL 20 uL ） 目的基因目的基因 AKPAKP 载体载体 pETBlue-2pETBlue-2 10 x Ligase 10 x Ligase bufferbuffer ddHddH2 2O OT T4 4DNADNA连接酶连接酶 X X uL uLY Y uLuL2 uL2 uLZ Z uL uL2 uL2 uL u 控制载体和目的基因的比例为控制载体和目的基因的比例为1 1：3 31:101:10 u 1

11、4 140 0C C连接过夜连接过夜 u 明天早晨明天早晨？点各组派代表收样品点各组派代表收样品 u 20200 0C C保存，用于转化受体细胞保存，用于转化受体细胞 实验操作连接实验操作连接 DNA重组酶切和连接20 连接产物转化克隆菌株连接产物转化克隆菌株 下次实验的简介与准备下次实验的简介与准备 DNA重组酶切和连接21 1. 0.1mol/L1. 0.1mol/L的的CaClCaCl2 2 100mL 100mL两组，两组，高压灭菌高压灭菌 2. LB2. LB液体培养基液体培养基 90mL/90mL/组，组，高压灭菌高压灭菌 胰蛋白胨（胰蛋白胨（typtone) 0.9gtypton

12、e) 0.9g 酵母提取物（酵母提取物（yeast extract) 0.45gyeast extract) 0.45g NaCl 0.9g NaCl 0.9g 先加先加90mL90mL水溶解后，水溶解后， 5mol/L NaOH 5mol/L NaOH调调pHpH值（值（18L18L） 分装：分装：250250mLmL锥形瓶，锥形瓶，40mL40mL2 2瓶；瓶； 15mL15mL大试管大试管, 5mL, 5mL2 2管。管。 试剂配制试剂配制 DNA重组酶切和连接22 1. 1. 试剂试剂 2. 2. 小指管：小指管： 1.5 mL 501.5 mL 50个个 3. 3. 枪头：枪头： 5

13、 mL 85 mL 8支支 4. 50 mL4. 50 mL离心管：离心管： 4 4个个 5. 5. 直径直径9cm9cm的平皿：的平皿： 8 8套套 6. 6. 其它枪头：各其它枪头：各1 1盒盒 灭菌灭菌 DNA重组酶切和连接23 1. X-gal1. X-gal 2. 2. 互补互补 3. 3. 感受态细胞制备感受态细胞制备 4. NovaBlue4. NovaBlue菌株菌株 5. Tuner(DE2)placI5. Tuner(DE2)placI菌株菌株 预习预习 DNA重组酶切和连接24 谢谢大家！谢谢大家！ DNA重组酶切和连接25 NovaBlueNovaBlue：来源于大肠杆

14、菌来源于大肠杆菌K12K12 基因型基因型 endAendA1 1 hsdRhsdR17 (r17 (rK K- -m mK K+ +) ) supEsupE44 44 thithi-1 -1 gyrAgyrA96 96 relArelA1 1 lac recAlac recA1/F1/FproAproA+ +B B+ + lacIlacIq qZM15 ZM15 TnTn10 10 ( (T Tetetr r) DNA重组酶切和连接26 endendA A：该基因表达非特异性核酸内切酶该基因表达非特异性核酸内切酶，它使所，它使所 有的有的DNADNA双链解开。双链解开。endAendA基因的

15、突变将使插入的外源基因的突变将使插入的外源 DNADNA更加稳定，提取的质粒纯度更高。更加稳定，提取的质粒纯度更高。 hsdRhsdR：该基因表达该基因表达型限制酶，对外源的各种型限制酶，对外源的各种DNADNA有有 严格的限制。严格的限制。hsdRhsdR基因的变异导致菌株细胞内的基因的变异导致菌株细胞内的 型限制酶活性缺失，这对外源基因的导入及质粒的型限制酶活性缺失，这对外源基因的导入及质粒的 转化是有利的。转化是有利的。 DNA重组酶切和连接27 hsdR17(rk12hsdR17(rk12- -mk12mk12+ +) )：表示表示R17 R17 的变异而导致的变异而导致K K菌菌 株

16、来源的株来源的hsdRhsdR的功能丧失。的功能丧失。 recA1recA1： recArecA为基因重组相关的基因，表达为基因重组相关的基因，表达ATPATP依依 赖型赖型DNADNA重组酶。该基因突变（重组酶。该基因突变（recA1recA1）导致同源或）导致同源或 异源异源DNADNA重组不能进行，保持插入重组不能进行，保持插入DNADNA的稳定性，对的稳定性，对 DNADNA的转化是有利的。的转化是有利的。 supE44 (Suppressor) supE44 (Suppressor) ： 该基因表达的阻遏蛋白该基因表达的阻遏蛋白 与终止密码子与终止密码子UAGUAG结合，使蛋白质合成

17、终止。结合，使蛋白质合成终止。 DNA重组酶切和连接28 Thi-1Thi-1： 该基因表达与硫氨素合成有关的蛋白和酶，该基因表达与硫氨素合成有关的蛋白和酶， thi thi 的变异使硫氨素的生物合成不能进行，最小培养的变异使硫氨素的生物合成不能进行，最小培养 基中必须添加硫氨素（基中必须添加硫氨素（VB1VB1），细胞才能正常生长。），细胞才能正常生长。 gyrA96(Gyrase):gyrA96(Gyrase): gyrA gyrA基因表达基因表达DNADNA促旋酶促旋酶A A亚基。亚基。 relA1relA1：是松弛调节基因，对是松弛调节基因，对RNARNA的合成具有调节抑制的合成具有调节抑制 机制。机制。relArelA基因的突变对目的基因的转录有利。基因的突变对目的基因的转录有利。 proABproAB：表达谷氨酸合成有关的酶。表达谷氨酸合成有关的酶。 DNA重组酶切和连接29 lacIlacIq q： laclac操纵子的调节基因，编码阻遏蛋白。操纵子的调节基因，编码阻遏蛋白。 LacLac