生物化学实验设计.ppt

1、 l 已知某蛋白的分子量约为已知某蛋白的分子量约为17 kda，等电点，等电点 3.94.1，它能耐一定的高温，在，它能耐一定的高温，在90 c加热加热 34 min后仍然能够保持后仍然能够保持80%的活性。该蛋白的活性。该蛋白 含有较多的疏水性残基，与含有较多的疏水性残基，与ca2+结合后可以暴结合后可以暴 露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生物体露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生物体 内酶的激活剂。请设计一个从脑组织中提取和内酶的激活剂。请设计一个从脑组织中提取和 分离纯化该蛋白的实验方案，要求写出具体的分离纯化该蛋白的实验方案，要求写出具体的 步骤和理由，以及检测方法。步骤和理由，以及

2、检测方法。 整个实验过程一般可分为整个实验过程一般可分为 5 个阶段：个阶段： 材料的选择和预处理材料的选择和预处理 细胞的破碎（有时细胞的破碎（有时 需进行细胞器的分离）需进行细胞器的分离）提取提取 纯化（包括等纯化（包括等 电点沉降法，盐析，有机溶剂沉淀，吸附、层析、电点沉降法，盐析，有机溶剂沉淀，吸附、层析、 等）等）分析鉴定。分析鉴定。 。 实验步骤：实验步骤： 二、二、a 细胞的破碎细胞的破碎 机械方法机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用 器械有：器械有： 玻璃匀浆器玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨（用两个磨砂面相互

3、摩擦，将细胞磨 碎）碎） 高速组织捣碎机（转速可达高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的，具高速转动的 锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎 物理方法物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎 的方法。的方法。 反复冻融法反复冻融法 冷热变替法冷热变替法 超声波法超声波法 化学及生物化学方法化学及生物化学方法 玻璃匀浆机玻璃匀浆机 b、细胞器的分离、细胞器的分离 细胞器的分离一般采用差速细胞器的分离一般采用差速离心离心法。细胞经过法。细胞经过 破碎后，在适当介质中进行差速离心。破碎后，在

4、适当介质中进行差速离心。 从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的，需进一从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的，需进一 步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质分开，将各种不步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质分开，将各种不 同的蛋白质分开。选择提取条件时，就要考虑尽量除去同的蛋白质分开。选择提取条件时，就要考虑尽量除去 非蛋白质。一般总是有其它物质伴随混入提取液中。但非蛋白质。一般总是有其它物质伴随混入提取液中。但 有些杂质（如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后有些杂质（如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后 操作。常用有机溶剂提取除去。操作。常用有机溶剂提取除去。 三、蛋白质粗提取三、蛋白质粗提

5、取 三、蛋白质粗提三、蛋白质粗提 取取 原理原理：利用蛋白质在：利用蛋白质在ph等电点时的溶等电点时的溶 解度最小，因而会以沉淀的方式析出。解度最小，因而会以沉淀的方式析出。 试剂：柠檬酸、磷酸氢二钠试剂：柠檬酸、磷酸氢二钠 步骤步骤： 1向试管中加入磷酸氢二钠和柠檬酸，使其向试管中加入磷酸氢二钠和柠檬酸，使其ph=4。 2将提取的溶液加入到第将提取的溶液加入到第1步骤所配的缓冲液中。步骤所配的缓冲液中。 3静置一段时间，待沉淀完全。静置一段时间，待沉淀完全。 4过滤或离心出粗产品。过滤或离心出粗产品。 ：防止局部过酸或过碱造成蛋白质变性。：防止局部过酸或过碱造成蛋白质变性。 金属螯合亲和层析

6、金属螯合亲和层析 固定化金属螯合亲和层析是建立在蛋白质表面的氨基酸固定化金属螯合亲和层析是建立在蛋白质表面的氨基酸 与固定化金属离子的亲和力的不同来进行蛋白质分离的一与固定化金属离子的亲和力的不同来进行蛋白质分离的一 项技术。过渡态金属离子能够与电子供体，如氮、硫、氧项技术。过渡态金属离子能够与电子供体，如氮、硫、氧 等原子以配位键结合，金属离子上剩余的空轨道是电子供等原子以配位键结合，金属离子上剩余的空轨道是电子供 体的配位点，当它在溶液中会被水分子或阴离子占据。体的配位点，当它在溶液中会被水分子或阴离子占据。 钙调蛋白的外形似哑铃钙调蛋白的外形似哑铃,有两个球形的末端有两个球形的末端,中间

7、被一个中间被一个 长而富有弹性的螺旋结构相连长而富有弹性的螺旋结构相连,每个末端有两个每个末端有两个ca2+ 结构域结构域, 每个结构域可以结合一个每个结构域可以结合一个ca2+ , 这样这样,一个钙调蛋白可以结一个钙调蛋白可以结 合合4个个ca2+ ,钙调蛋白与钙调蛋白与ca2+ 结合后的构型相当稳定结合后的构型相当稳定 。 四、精细纯化四、精细纯化 值得注意的是值得注意的是，在洗脱时，会有少许配基与蛋白，在洗脱时，会有少许配基与蛋白 质一同被洗脱下来，因此常在其后加一凝胶层析质一同被洗脱下来，因此常在其后加一凝胶层析 以除去小分子的配基。以除去小分子的配基。 属最常用的蛋白质分离方法。系混

8、合属最常用的蛋白质分离方法。系混合 物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时， 混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。 在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶 网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子 量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速 缓慢，致使最后流出柱外。缓慢，致使最后流出柱外。 五、分析鉴定五、分析鉴定 a、定性分析、定性分析 b、定量分析、定量分析 紫

9、外检测法、考马斯亮蓝法、紫外检测法、考马斯亮蓝法、folin-folin-酚试剂法（最常用方法）酚试剂法（最常用方法） folin-酚试剂法酚试剂法包括两步反应：包括两步反应：第一步第一步是在碱性条件下，是在碱性条件下， 蛋白质与铜作用生成蛋白质蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；铜络合物；第二步第二步是此络合物是此络合物 将磷钼酸将磷钼酸-磷钨酸试剂（磷钨酸试剂（folin 试剂）还原，产生深蓝色试剂）还原，产生深蓝色 （磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正 比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范倍，定量范 围为围为5100g 蛋白质。蛋白质。folin 试剂显色反应由酪氨酸、色试剂显色反应