CN120209125A 单克隆抗体与分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞及应用

(19)国家知识产权局地址100193北京市海淀区圆明园西路2号王海杰公司11245专利代理师魏少伟单克隆抗体与分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞及应用本发明公开了单克隆抗体与分泌单克隆抗目的是提供一种单克隆抗体及分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞为杂交瘤细胞3G3,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏基于该单克隆抗体的基于阻断ELISA法的体检测试剂盒可用于检测牛病毒性腹泻病毒的21.单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞3G3分泌的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞3G3在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为2.单克隆抗体在制备检测牛病毒性腹泻病毒的中和抗体的产品中的应用，其特征在于：所述单克隆抗体为权利要求1所述的单克隆抗体。3.单克隆抗体在检测牛病毒性腹泻病毒的中和抗体中的应用，其特征在于：所述单克隆抗体为权利要求1所述的单克隆抗体。4.单克隆抗体在制备检测牛病毒性腹泻病毒的产品中的应用，其特征在于：所述单克隆抗体为权利要求1所述的单克隆抗体。5.试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1所述的单克隆抗体。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为基于阻断ELISA法的BVDV抗体检测试剂盒，所述单克隆抗体标记有辣根过氧化物酶。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有E2蛋白质、BVDV抗体所述样品稀释液为PBST;所述封闭液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为PBST,所述溶质及其在所述封闭液中的浓度分别为2.5g/100mL明胶和5g/100mL蔗糖。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述E2蛋白质为SEQIDNo.2的第28-371位所示的E2蛋白质，或为SEQIDNo.2所示的重组E2蛋白。9.杂交瘤细胞，其特征在于：所述杂交瘤细胞为杂交瘤细胞3G3,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.46345。10.杂交瘤细胞的应用，其特征在于：所述杂交瘤细胞为杂交瘤细胞3G3,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.46345:所述应用为在制备BVDV单克隆抗体中的应用，或在制备检测牛病毒性腹泻病毒的中和抗体的产品中的应用，或在制备检测牛病毒性腹泻病毒的产品中的应用。3单克隆抗体与分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞及应用技术领域[0001]本发明属于肽领域，具体涉及单克隆抗体与分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞及应背景技术[0002]牛病毒性腹泻(BovineViralDiarrhea,BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(BovineViralDiarrheaVirus,BVDV)引起的一种严重传染病，主要影响牛和羊，也可感染猪和野生反刍动物。该病传播速度快，呈全球分布，对养牛业造成严重经济损失。BVDV为黄病毒科养牛业的健康发展。近年来，已推广使用灭活疫苗，而免疫牛在接种疫苗后多久才能够产生有效保护水平的中和抗体以及有效保护水平的中和抗体的持续时间，是评估疫苗免疫效果的重要指标。NeutralizationTest,VNT)和酶联免疫吸附实验(Enzyme-linkedImmunosorbentBVDV中和抗体的首选方法。现有研究中，已开发了基于NS3蛋白的阻断ELISA、基于EO蛋白的竞争ELISA以及全病毒的间接ELISA方法。基于NS3蛋白的阻断ELISA可以检测NS3蛋白的血清抗体，适用于鉴别野毒感染和灭活疫苗免疫牛，以供淘汰感染牛实施净化所用。基于E0蛋白的竞争ELISA和全病毒的间接ELISA方法分别可以检测E0蛋白的血清抗体和病毒的血清总抗体，均适用于牛病毒性腹泻病毒流行病学调查、非免疫场牛病毒性腹泻病毒感染牛筛查等，但不适用于检测中和抗体水平。[0004]随着分子生物学技术的进步，单克隆抗体(MonoclonalAntibodies,mAb)已成为没有可用于BVDV疫苗免疫效力评价的商品化ELISA检测试剂盒，已有的基于NS3蛋白的阻断ELISA、基于E0蛋白的竞争ELISA以及全病毒的间接ELISA试剂盒，主要检测NS3、E0及全病毒抗体，并且只是定性判断NS3、E0抗体或病毒总抗体的阴性或阳性，而不能特异性地评价牛量检测牛病毒性腹泻灭活疫苗中和抗体的ELISA试剂盒，替代操作繁琐、周期长、重复性差的病毒中和试验方法。发明内容[0005]本发明的目的是提供一种单克隆抗体及分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。[0006]本发明提供的单克隆抗体，是由杂交瘤细胞3G3分泌的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞3G3在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.46345。[0007]本发明还提供了所述单克隆抗体在制备检测牛病毒性腹泻病毒的中和抗体的产品中的应用。所述产品可为试剂盒。4[0008]本发明还提供了所述单克隆抗体在检测牛病毒性腹泻病毒的中和抗体中的应用。[0009]本发明还提供了所述单克隆抗体在制备检测牛病毒性腹泻病毒的产品中的应用。[0011]本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有所述单克隆抗体。[0012]所述试剂盒可用于检测BVDV抗体。具体的，所述BVDV可为牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)或牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV-2)。标记有辣根过氧化物酶。液和封闭液；所述样品稀释液可为PBST;所述封闭液可由溶剂和溶质组成，所述溶剂为PBST,所述溶质及其在所述封闭液中的浓度分别为2.5g/100mL明胶和5g/100mL蔗糖。[0015]所述样品稀释液可用于稀释待测血清和标记有辣根过氧化物酶的单克隆抗体。[0016]所述BVDV抗体阳性血清可按照如下方法得到：采用牛病毒性腹泻/黏膜病灭活疫苗(1型，NMO1株)免疫健康犊牛，当中和试验检测中和抗体效价不低于1:1024时采集血清，[0017]所述BVDV抗体阴性血清可按照如下方法得到：采集BVDV中和抗体阴性的健康犊牛[0018]上述试剂盒中，所述E2蛋白质可为SEQIDNo.2的第28-371位所示的E2蛋白质，或为SEQIDNo.2所示的重组E2蛋白。所述洗涤液为PBST;所述底物A液：TMB双组分显色液A液(北京索莱宝科技有限公司，货号PR12所述底物B液：TMB双组分显色液B液(北京索莱宝科技有限公司，货号PR1210);所述终止液为1MHCl水溶液。[0020]本发明还提供了一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞为杂交瘤细胞3G3,其分泌所述单克隆抗体，所述杂交瘤细胞3G3在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保[0021]本发明还提供了所述杂交瘤细胞在制备BVDV单克隆抗体中的应用，或在制备检测牛病毒性腹泻病毒的中和抗体的产品中的应用，或在制备检测牛病毒性腹泻病毒的产品中的应用。[0022]所述产品可为试剂或试剂盒。[0023]本发明的单克隆抗体及将该单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记后制备基于阻断ELISA法的BVDV抗体检测试剂盒具有以下优点：(1)特异性强：单克隆抗体能特异性识别牛病毒性腹泻病毒1型和2型，且与经典猪瘟病毒、牛疱疹病毒1型、牛副流感病毒3型、牛结节性皮肤病病毒均不产生交叉反应，利用本发明的试剂盒检测BVDV抗体阳性血清及其他牛传染病阳性血清，对其他牛传染病阳性血清(牛口蹄疫病毒抗体阳性血清、牛疱疹病毒1型抗体阳性血清、牛布鲁氏菌抗体阳性血清、牛致病大肠杆菌抗体阳性血清和牛支原体抗体阳5性血清)的检测结果均为阴性。(2)敏感性好：利用本发明的试剂盒对28份经中和试验鉴定的BVDV抗体弱阳性血清样品进行检测，结果显示与中和试验的阳性符合率为100%。(3)灵敏度高：将BVDV抗体阳性血清(中和效价1:4096)按4倍梯度稀释，采用本发明的试剂盒与中和试验同时进行检测，本发明的方法灵敏度可达1:1024稀释度，与中和试验结果一致。(4)与其他方法的检测结果一致性好：分别采用本发明的试剂盒、中和试验以及美国爱德士公司(IDEXXLaboratories,Inc.)的检测试剂盒(简称为IDEXX试剂盒)同时检测218份牛血清样品，比较三种检测方法之间的符合率。结果表明：本发明的试剂盒与中和试验的阳性符合率为98.65%,阴性符合率为92.86%,总符合率为96.79%;与IDEXX试剂盒相比，本发明的试剂盒与中和试验的符合率更好，且特异性更高。(5)检测效率高：采用本发明的单克隆抗体与试剂盒检测过程不足1.5小时，操作更简便，且检测时间大大缩短。(6)准确性高：利用本发明的试剂盒对批量样本进行检测并进行ROC曲线分析，当PI值为24.72%时，此时诊断敏感性为93.33%,诊断特异性为93.33%,ROC曲线下面积为0.9856,说明本发明的试剂盒具有高准确性。(7)疫苗免疫效果评价：本发明的试剂盒检测血清结果为PI值与中和抗体效价有一定的对应关系，因此可以根据PI值判断血清样品中和抗体的阴性、阳性以及阳性血清中和效价的范围，并可进一步根据攻毒保护试验中获得免疫保护牛的最低中和抗体标准来判断血清样品抗体水平能否为免疫犊牛提供有效的免疫保护，从而为评估疫苗免疫效果提供一种科学、可靠的检验方法和产品。综上，本发明的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体具有敏感性好、特异性强的优点，且检测操作简便、快速。本发明的单克隆抗体能够半定量检测血清中的牛病毒性腹泻病毒中和抗体水平，为BVDV疫苗免疫效果评价提供了一种快速、可靠的检[0024]下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。[0025]生物材料保藏说明保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心分类命名：杂交瘤细胞(Musmusc附图说明的片段插入的位置。[0027]图2.感染重组杆状病毒的Sf9细胞鉴定结果。左图为核染色结果，中图为重组E2蛋白的检测结果，右图为两幅图叠加结果。6道M为蛋白分子量标准，泳道1为正常Sf9细胞培养上清，泳道2为感染杆状病毒BV的Sf9细胞培养上清，泳道3为感染重组杆状病毒rBV-E2的Sf9细胞培养上清；B:细胞裂解上清样品组，胞裂解上清，泳道3为感染重组杆状病毒rBV-E2的Sf9细胞裂解上清。箭头所示为目的蛋白。标准，泳道1为目的蛋白检测结果。箭头所示为目的蛋白。[0030]图5.三免后小鼠血清效价检测结果。[0031]图6.3G3株杂交瘤细胞分泌抗体稳定性检测结果。[0033]图8.3G3单抗Westernblot验证结果。泳道M为蛋白分子量标准，泳照，泳道2为目的蛋白检测结果。[0034]图9.试剂盒临界值确定ROC曲线。具体实施方式[0035]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置至少三次重复实验。[0037]下述实施例中的牛病毒性腹泻病毒1型JL株(BVDV-1JL株)记载在“刘梦瑶，王展实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].畜牧兽医学报，2021,52(07):1942-1952”一文中，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。[0038]下述实施例中的牛病毒性腹泻病毒2型HLJ-10株(BVDV-2HLJ-10株)记载在“刘梦病毒四重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].畜牧兽医学报，2021,52(07):1942-1952”一文中，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。[0039]下述实施例中的猪瘟病毒(CSFV):中国兽医药品监察所(CVCCAV280)。[0040]下述实施例中的牛疱疹病毒1型(BoHV-1)记载在“PengpengWang,ShulinHuang,ChengwuHao,ZhanhuiWang,HaoranZhao,MengyaoLiuXinruiGe,WenxueWu,andChenPeng.EstablishmentSerum-FreeMediumforProductionofBovineAlphaherpesvirus-1.Vaccines2021,9,1006./10.3390/vaccines9091006”一文中，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。7浩，谷月，吴文学.牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和牛轮状病毒四重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].畜牧兽医学报，2021,52(07):1942-1952”一文中，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。[0042]下述实施例中的牛结节性皮肤病病毒(LSDV)记载在“XieS,CuiL,LiaoZ,etal.Genomicanalysisoflumpyskievaluationofitscellulartropism.NPJVaccines.2024Mar21;9(1):65.doi:10.1038/s41541-024-00846-8”一文中，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。[0043]DH10Bac感受态[0045]BVDVE2蛋白单抗(即BovineViral[0046]HRP标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(即HRP-conjugatedGoatanti-MouseIgG(H+L)):爱博泰克生物科技有限公司，货号AS003。[0047]HRP标记的兔抗山羊IgG(H+L)抗体(即HRP-conjugatedRabbitanti-GoatIgG[0048]FITC标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体：上海碧云天生物技术股份有限公司，货号Reagents):西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma-Aldrich),货号ISO2。该试剂盒内含有山羊抗小鼠IgG1特异性抗体、山羊抗小鼠IgG2a特异性抗体、山羊抗小鼠IgG2b特异性抗体、山羊抗小鼠IgG3特异性抗体、山羊抗小鼠IgA特异性抗体、山羊抗小鼠IgM特异性抗[0050]6-8周龄雌性BALB/c小鼠：北京维通利华实验动物技术有限公司。[0051]BVDV抗体阳性血清：采用牛病毒性腹泻/黏膜病灭活疫苗(1型，NM01株)免疫健康犊牛，当中和试验检测中和抗体效价不低于1:1024时采集血清，56℃灭活30min,加入终浓泻/黏膜病灭活疫苗(1型，NM01株)为天康生物制药有限公司产品，批号2023007。[0052]BVDV抗体阴性血清：采集BVDV中和抗体检测阴性的健康犊牛血清，56℃灭活30[0053]牛口蹄疫病毒抗体阳性血清：采用牛口蹄疫0型、A型二价灭活疫苗(0/MYA98/BY/2010株+Re-A/WH/09株)按说明书免疫健康犊牛，用牛、羊口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附诊断试剂盒检测抗体转阳后采集血清，56℃灭活30min,加入终浓度为0.01%硫柳苗(0/MYA98/BY/2010株+Re-A/WH/09株)为申联生物医药(上海)股份有限公司产品，批号：[0054]牛疱疹病毒1型抗体阳性血清：采用牛疱疹病毒1型(BoHV-1)Us9基因缺失疫苗(为8中国专利申请202310884644.0(牛疱疹病毒1型Us9基因缺失疫苗株的构建及应用)中的牛疱疹病毒1型基因缺失弱毒株)免疫健康犊牛，当中和试验检测中和抗体效价不低于1:32时采集血清，56℃灭活30min,加入终浓度为0.01%硫柳汞钠，用0.22μm孔径滤膜过滤除[0055]牛布鲁氏菌抗体阳性血清：采用布鲁氏菌病活疫苗(A19株)免疫健康牛，用牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒(北京明日达科技发展有限责任公司，批号20231109)检测抗体转阳后，56℃灭活30min,加入终浓度为0.01%硫柳汞钠，用0.22μm孔径滤膜过滤除菌，置-70℃以下保存。其中，布鲁氏菌病活疫苗(A19株)为哈尔滨维科生物技术有限公司产[0056]牛致病性大肠杆菌抗体阳性血清：采用LB肉汤培养基(北京奥博星生物；货号：02-136)培养牛致病性大肠杆菌05血清型B4株(张云科学位论文.牛源大肠杆菌galE基因缺失株的构建及其生物学特征研究.2017)至10¹⁰CFU/ml,经30%甲醛灭活后加弗氏佐剂乳化制备灭活疫苗，颈部肌肉免疫健康犊牛，2ml/头，间隔14日相同剂量和途径二免，当试管凝集试验法检测大肠杆菌血清抗体效价不低于1:40时采集血清，56℃灭活30min,加入终浓度为[0057]牛支原体抗体阳性血清：采用PPLO培养基(BD公司，货号：0175457)培养牛支原体PD株(ZhaoHaoranWenxue;PengChen.MBOVPG45_0375EncodesanIgG-Bindin0376EncodesanIgG-CleavingProteininMycoplaApr15;8:644224)至10¹CFU/ml,经BEI灭活后加弗氏佐剂乳化制备灭活疫苗，颈部肌肉免疫健康犊牛，2ml/头，间隔14日相同剂量和途径二免，当商品化牛支原体ELISA抗体检测试剂盒(北京标驰泽惠生物科技有限公司，生产批号E53202401)检测血清抗体转阳后，56℃灭[0059]中和试验的具体操作步骤如下：[0060](2)将血清置于56℃水浴灭活30mi[0061](3)用维持培养基将待检血清和BVDV抗体阴性血清和阳性血清从1:4、1:8依次稀释至1:256,分别将待检血清和阴、阳性血清加到96孔细胞培养板孔中，每孔120μL,每组重复2孔。设置只加维持培养基的空白对照孔。[0062](4)每孔加200TCID₅o/0.1mL的病毒悬液120μL,所用病毒为BVDV-1JL株。[0063](5)用维持培养基将10⁴TCID₅₀/0.1mL的病毒液做4次10倍连续稀释，每一个稀释度4孔，每孔加病毒悬液120μL,做病毒回归对照。[0065](7)弃去96孔板中培养基，PBS清洗2次。吸取100μL[0066](8)用倒置显微镜观察并记录有无细胞病变的细胞孔数，按Reed-Muench法计算其半数保护量(PD₅),然后计算该血清的中和效价。[0067]PBST:取PBS磷酸盐缓冲液粉包(北京索莱宝科技有限公司生产，规格：溶解并稀释9至2L/包)10包，加入20L去离子水充分溶解，加入10ml吐温-20,121℃高压30分钟。放置室温后，加入终浓度0.04%的Proclin300,混匀后无菌定量分装。[0068]实施例1.BVDV重组E2蛋白的表达与纯化以经过密码子优化的BVDVNADL株E2基因序列和含有HBM标签与His标签的DNA片段为基础，制备HBM-His-E2融合基因(其序列为SEQIDNo.1)。[0069]SEQIDNo.1中，第1-16位所示为上游同源臂，第17-79位所示为HBM信号肽的DNA序列，第80-97位所示为His标签的DNA序列，第98-1132位所示为优化后的E2基因序列，第1133-1148位所示为下游同源臂。[0070]通过双酶切方法(限制性内切酶SalI和PstI)使pFastBacDual载体线性化，得到线性化载体；利用同源重组酶将线性化载体与BM-His-E2融合基因进行同源重组，将得到的序列正确的重组载体记为pFastBacDual-E2质粒(图1)。[0071]pFastBacDual-E2质粒为将载体pFastBacDual的SalI和PstI识别序列间的DNA片段替换为SEQIDNo.1的第17-1132位所示的DNA片段得到的重组质粒，该质粒由polyhedrin(PH)启动子驱动目标基因的表达，能表达SEQIDNo.2所示的HBM-His-E2融合蛋白质(即重组E2蛋白)。位所示为E2蛋白质。杆粒提取试剂盒按照说明书步骤提取重组杆粒rBacmids-E2。取Sf9细胞加入5倍体积的ITSFM03培养基，1,000rpm离心5min,弃去上清，细胞沉淀用培养基重悬，调整细胞密度为1×10⁶个/mL,在27℃、125rpm条件下悬浮培养3天，传代3次后用于拯救实验。将密度为4×10⁵个/mL的Sf9细胞铺至6孔细胞培养板，每孔2mL。在转染前，用100μL不含抗生素的ITS8μL转染试剂CellfectinII,混合后室温孵育制成杆粒-转染试剂混合物，加入细胞培养液中，27℃静置培养35h后更换为含抗生素的培养基继续培养。约3天后观察细胞状态，待PO病毒液连续传代3次，获取滴度稳定的重组杆状病毒株rBV-E2。[0075]按照步骤2的方法，将“pFastBacDual-E2”替换为“pFastBacDual”,其他步骤均不变，得到杆粒Bacmids;按照步骤3的方法，将“rBacmids-E2”替换为“Bacmids”,其他步骤[0076]4、鉴定重组E2蛋(1)间接免疫荧光分析将重组杆状病毒株rBV-E2和重组空载体杆状病毒BV分别接种于24孔板培养的Sf9细胞，培养3天后，弃去培养上清液并进行固定。弃去封闭液，用PBST洗涤2次，加入1:500稀释的作为一抗的BVDVE2蛋白单抗，37℃作用2h.弃去一抗后，用PBST洗涤3次，加入1:1,000稀释的作为二抗的FITC标记的山羊抗小鼠IgG结果。如图2所示，在感染重组杆状病毒rBV-E2的Sf9细胞检测到绿色荧光，而感染重组空载体杆状病毒BV的对照组无荧光，表明重组E2蛋白成功在Sf9细胞中表达。[0077](2)Westernblot分析将重组杆状病毒株rBV-E2或重组空载体杆状病毒BV接种于Sf9细胞，培养3天后，经1,000rpm离心10min收集细胞培养上清和细胞团沉淀。细胞团沉淀经裂解后以12,000rpm离心10min,收集细胞裂解上清，以细胞培养上清和细胞裂解上清作为待测样品。将正常Sf9细胞按相同方法处理作为空白对照。将待测样品进行SDS后再通过Westernblot进行检测，E2的检测抗体为1:5,000稀释的BVDVE2蛋白单抗和1:8,000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体，封闭液为含5%脱脂奶粉的PBST。结果如图3所示，重组E2蛋白正确表达，得到预期分子量约50kDa的蛋白，并在细胞培养上清及细胞中均检测到E2蛋取HighFive细胞加入5倍体积的ITSFM03培养基，1,000rpm离心5min,弃去上清，用ITSFM03培养基重悬细胞沉淀后转移至摇瓶中，调整细胞密度至1×10⁶个/mL,在27℃、125rpm条件下悬浮培养2天并传代3次。将Hig摇瓶中，工作体积为30mL,当细胞密度达3×10⁶个/mL时，以MOI=3接种重组杆状病毒rBV-E2,在27℃、125rpm条件下培养2天，结束培养后以2,000rpm离心10min去除细胞沉淀，再以12,000rpm离心30min去除细胞碎片和杂质，收获上清液作为重组E2蛋白样品。通过饱和硫酸铵法对样品初步纯化，利用Ni亲和层析进一步纯化带有His标签的重组E2蛋白，纯纯化获得高纯度的重组E2蛋白。[0079]实施例2.抗BVDVE2蛋白单克隆抗体的制备与纯化选取6周龄BALB/c雌性小鼠4只，其中3只以实施例1中得到的纯化后的重组E2蛋白抗原进行免疫，剩余1只小鼠作为阴性对照，不免疫。免疫组每只小鼠皮下多点注射200μL乳化液(由抗原与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂乳化制成)。免疫程序为：第0天第一次免各皮下多点注射100μg抗原，使用弗氏不完全佐剂；第35天加强免疫(第四次免疫),腹腔注射100μg抗原，无佐剂。阴性对照小鼠仅注射利用第四次免疫后的小鼠血清建立杂交瘤细胞筛选用间接ELISA方法。11[0081](1)用抗原包被液(0.05mol/L,pH值9.6±0.2的碳酸盐缓冲液),将重组E2蛋白[0082](2)每孔加入5%脱脂乳溶液200μL,37℃封闭[0083](3)小鼠血清样品按1:200至1:25600梯度稀释，每个样品设3个重复孔，100μL/[0084](4)用2.5%脱脂乳将HRP标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体按1:5000稀释，每孔加[0086](6)加入ELISA终止液(1MHCl)50μL/孔，终止显色后在5min内测450nm吸光[0087](7)计算P/N值(免疫组小鼠血清吸光度与阴性对照小鼠血清吸光度之比),P/N>2时判为阳性(即表示免疫组小鼠成功产生了E2抗体),否则为阴性。选取抗体效价最高的小鼠用于细胞融合实验，制备单抗。如图5所示，2号和3号小鼠免疫效果较好，3号小鼠效价最融合前30天复苏SP2/0细胞，传代培养至对数生长期，收集状态良好的细胞备用，同时收集培养上清作为阴性对照。融合前24小时制备饲养层细胞，将健康BALB/c小鼠腹腔细胞稀释至约1×10⁵个/mL,接种于96孔板中培养。融合用脾细胞取自加强免疫后第3天的BALB/c小鼠，麻醉采血后无菌获取脾脏，制备脾细胞悬液备用。将脾细胞与SP2/0细胞按2:1比例混合，使用50%PEG1450诱导融合，融合后缓慢重悬细胞并接种至含饲养层细胞的96孔板中，置37℃、5%CO₂培养箱培养。融合后第4天观察细胞生长，第7天通过抗体活性，筛选阳性克隆。培养初期使用HAT培养基，每3株为包被抗原检测杂交瘤细胞培养上清。通过方阵滴定法优化包被条件(重组E2蛋白浓度或BVDV病毒液稀释度),以阳性/阴性吸光值比(P/N值)最大且阳性血清OD450接近1.0为最8稀释后包被时P/N值最大(表1);包被0.5μg/mL的重组E2蛋白时P/N值最大(表2),以此建立间接ELISA方法，检测杂交瘤细胞分泌的单抗上清，筛选阳性单克隆细胞。对两次检测均阳性的杂交瘤细胞进行有限稀释亚克隆，经过2-4次克隆化获得稳定分泌单克隆抗体的细BVDV病毒包被稀释度血清稀释度PNPNPNPNPNPN表2重组E2蛋白包被量优化结果重组E2蛋白包被浓度(μg/mL)血清稀释度PNPN1PN2PN将筛选得到的杂交瘤细胞株以5×10⁵个/mL密度接种至T175培养瓶，加入30mL含上清液冻存备用。利用辛酸-硫酸铵法纯化抗体：将上清液与醋酸盐缓冲液按1:2混合，加入33μL/mL正辛酸，室温搅拌30min,4℃静置4h至终浓度45%,静置4小时后再次离心。用PBS重悬沉淀，12,000rpm离心5min除杂，超滤去除硫酸铵并换液3次，获得各杂交瘤细胞的纯(1)单克隆抗体的亚类鉴定使用小鼠单克隆抗体分型试剂进行间接ELISA实验，测定单抗类别。包被抗原为重组E2蛋白，与杂交瘤细胞分泌的单抗上清液共孵育。检测抗体分别为山羊抗小鼠IgG1特异性抗体、山羊抗小鼠IgG2a特异性抗体、山羊抗小鼠IgG2b特异性抗体、山羊抗小鼠IgG3特异性抗体、山羊抗小鼠IgA特异性抗体、山羊抗小鼠IgM特异性抗体，酶标抗体为HRP标记的兔细胞(8E1、9F3)的单克隆抗体为IgG2a,3株杂交瘤细胞(2H5、5H7、7C12)的单克隆抗体均为表37株单克隆抗体类别间接ELISA鉴定结果单抗[0095](2)单克隆抗体的效价测定采用重组E2蛋白包被酶标板，以HRP标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体为酶标二抗，将纯化后的各杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体进行梯度稀释后，按照步骤“2、检测血清抗体3G3的效价最高，检测限度可达1:51200,单抗7D6效价1:25600(表4);IgG2a类单抗9F3的效价可达1:25600,单抗8E1效价1:6400(表5);IgM类抗体效价(表6)分别为2H5(1:1600)、5H7(1:800)、7C12(1:800),均低于3G3单抗。所以以杂交瘤细胞3G3分泌的3G3单抗进行后续实表4IgG1类单抗效价检测结果阴性对照阴性对照表6IgM类单抗效价检测结果阴性对照[0099]杂交瘤细胞3G3已于2025年04月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通[0100](3)杂交瘤细胞株的传代稳定性测定将所得的杂交瘤细胞株3G3体外连续传代培养10代，分别收集细胞上清，用建立的间接ELISA方法进行检测。测定杂交瘤细胞株分泌抗体的稳定性。如图6所示，在连续传代10次后，3G3细胞株仍然可以稳定分泌单抗，具有良好的稳定性。毒3型(BPIV-3)SD0835株、牛结节性皮肤病病毒(LSDV)、猪瘟病毒(CSFV)。利用BVDV-1JL染48h后，以3G3单抗作为一抗，FITC标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体作为二抗，进行间接免疫荧光(IFA)鉴定单抗特异性。具体操作如下：制备5×10⁵个/mL细胞悬液，接种在24孔板，37℃5%CO₂培养12h。以MOI=0.1将待测病毒接种细胞单层并孵育细胞2h,弃去接种物，用PBS洗贴壁细胞3次以去除未感染病μL用PBST以1:1000稀释的FITC标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体作为二抗，室温避光孵育1[0102]结果如图7所示，3G3单抗与BVDV-1JL株(图7中B)、BVDV-2HLJ-10株(图7中C)均[0103](5)Westernblot分析取实施例1得到的纯化的重组E2蛋白进行Westernblot分析，以3G3单抗(1:2000稀释)作为一抗，以HRP标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(1:5000稀释)作为二抗。如图8所示，3G3鼠源单抗(即3G3单抗)能与E2蛋白结合，条带大小约为50kDa。[0104]实施例3.用于BVDV中和抗体检测的阻断ELISA方法的建立使用商品化“醛基活化的辣根过氧化物酶”对E2蛋白单抗(即3G3单抗)进行辣根过氧化物酶(HRP)标记，步骤如下：[0105](2)室温、避光孵育4h,在混匀仪上摇动。[0106](3)加1/10反应体积4mg/mL硼氢化钠。[0107](4)涡旋混匀，室温黑暗条件下在混匀仪上孵育30min。[0108](5)加100μL0.5M的Tris-HCl到反应管中。[0109](6)涡旋混匀，室温黑暗条件下在混匀仪上孵育30min。[0110](7)在1mL超滤管中将缓冲液置换为PBS,尽量浓缩减少体积，即得到辣根过氧化物酶标记的3G3单抗。[0111](8)抗体中加入防腐剂ProClin300,30～50%甘油，混匀后-20℃保存。[0112]2、最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度的确定用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L,pH值9.6±0.2)将浓度为25mg/mL的重组E2蛋白(实施例1制备)分别稀释至0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL作为包被抗原，按100μL/孔的量包被酶标板。将BVDV抗体阳性血清和BVDV抗体阴性血清用PBST按1:5、1:10、1:25、1:50、1:100、1:250、1:500的比例稀释。用HRP标记的3G3单抗与BVDV抗体阳性血清和BVDV抗体阴性血清进行阻断ELISA,通过棋盘滴定试验，以最高的阻断率PI值(PI释度分别作为抗原最佳包被浓度和血清稀释度。结果表明，最佳抗原包被浓度为0.01~0.05μg/孔，最佳血清稀释度为1:10,表7。表7使用不同抗原包被浓度和血清稀释度的棋盘滴定试验结果血清稀释度抗原包被浓度(μg/mL)1NPNPNPNPNPNPNP分别配制含5%绵羊血清+5%蔗糖的PBST溶液(每95mLPBST中加入5mL绵羊血清和5g蔗糖)、含2%海藻糖+5%蔗糖的PBST溶液(每100mLPBST中加入2g海藻糖和5g蔗糖)、含2.5%明胶+5%蔗糖的PBST溶液(每100mLPBST中加入2.5g明胶和5g蔗糖)、含1.5%卵清蛋白+5%蔗糖的PBST溶液(每100mLPBST中加入1.5g卵清蛋白和5g蔗糖),作为封闭液。使用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L,pH值9.6±0.2)配制0.25μg/mL的重组E2蛋白溶液，按性血清和阴性血清(1:10稀释),与HRP标记的3G3单抗进行阻断ELISA,根据阻断率PI值(PIPI值最大，因此含2.5%明胶+5%蔗糖的PBST溶液为最佳封闭液。表8不同封闭液封闭后的试验结果封闭液NP5%绵羊血清+5%蔗糖2%海藻糖+5%蔗糖2.5%明胶+5%蔗糖1.5%卵清蛋白+5%蔗糖使用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L,pH值9.6±0.2)配制0.25μg/mL的重组E2蛋白溶液，按100μL/孔的量包被酶标板。使用最佳封闭液封闭。将HRP标记的3G3单抗用PBST分别按1:50、1:60、1:70、1:80稀释后，与BVDV抗体阳性血清和BVDV抗体阴性血清(1:10稀释)进行阻断ELISA,根据阻断率PI值(PI=1-阳性血清孔的0D₄50nm值/阴性血清孔的0D450nm值)确定最佳酶标单抗稀释度。结果(表9)显示，酶标单抗浓度0.2～1.0μg/mL时PI值无显著区别，所以最佳酶标单抗浓度为0.2～1.0μg/mL。表9不同酶标单抗稀释度的试验结果酶标单抗浓度μg/mLNP液对BVDV抗体阳性血清和抗体阴性血清按1:10的比例进行稀释，与HRP标记的3G3单抗且差异不显著,因此最佳样品稀释液为PBST。表10不同样品稀释液的测定结果样品稀释液NP含15mg/mLBSA的PBST溶液含5%(v/v)绵羊血清的PBST溶液1)抗原包被板，即已经用重组E2蛋白的碳酸盐缓冲液稀释液按0.01～0.05μg/孔包被并用封闭液(2.5%明胶+5%蔗糖的PBST溶液)封闭的96孔酶标板；4)样品稀释液，即PBST,用于稀释待测血清与酶标单抗，待测血清可按1:10稀释；5)酶标单抗，即辣根过氧化物酶标记的3G3单抗，酶标单抗的工作浓度为0.2～1.06)封闭液，即2.5%明胶+5%蔗糖的PBST溶液(每100mLPBST中加入2.5g明胶和5g蔗糖);11)封板膜。(1)样品准备取动物全血，待血液凝固后，以3000r/min离心10分钟，收集上清液。[0122](2)样品稀释用样品稀释液将待检血清、BVDV抗体阳性血清和BVDV进行1:10稀释。[0123](3)样品准备使用前将试剂盒恢复至室温。液体试剂应轻轻旋转或振荡混匀。[0124](4)编号取出抗原包被板(根据样品多少，可拆开分多次使用),在记录本上记录样品的位置。[0125](5)加样将稀释后的BVDV抗体阳性血清、BVDV抗体阴性血清和待检血清依次加入[0126](6)孵育用膜封盖酶标板，置37℃恒温培养箱内孵育1h。[0127](7)洗板弃去孔中液体，每孔加入稀释好的洗涤液200μL,轻微混合后，弃去洗涤[0128](8)加酶标单抗在样品孔内加入酶标单抗100μL/孔，酶标单抗由PBST稀释至0.2吸头，并准确记录每个样品在板上的位置。[0129](9)孵育用封板膜封好，置37℃孵育1小时。[0130](10)洗板弃去孔中液体，重复步骤(7)。[0131](11)显色将底物A液和B液等比例混匀后，每孔加入100μL,盖上封板膜，置置37℃避光显色10分钟。[0132](12)终止每孔加入终止液50μL(10分钟内测定结果)。[0133](13)测定设定酶标仪波长于450nm处，用空白孔调零后测定各孔OD值。[0135]7、试剂盒临界值的确定采用上述试剂盒，按照试剂盒操作步骤对BVDV抗体阳性血清30份、BVDV抗体阴性血清30份进行检测，测定所有样品的0D450nm值，并计算PI值，结果见表11。PI值=(1-样品值+阴性对照2号孔的0D450n值)/2.阴性对照是指试剂盒中的BVDV抗体阴性血清。[0136]其中，30份BVDV抗体阳性血清的制备：采用牛病毒性腹泻/黏膜病灭活疫苗(1型，NM01株)免疫健康犊牛，当中和试验检测中和抗体效价不低于1:1024时采集血清，56℃灭活30min,加入终浓度为0.01%硫柳汞钠，用0.22μm孔径滤膜过滤除菌，置-70℃以下保存。[0137]30份BVDV抗体阴性血清的制备：采集BVDV中和抗体检测阴性的健康犊牛血清，56℃灭活30min,加入终浓度为0.01%硫柳汞钠，用0.22μm孔径滤膜过滤除菌，置-70℃以下保存。表11试剂盒检测样本结果4.14%利用GraphPadPrism8.0.2软件进行ROC曲线分析最终确定阴、阳性血清的临界值。以血清背景结果与本试剂盒的检测结果为基础，分析所检样品的PI值与敏感性、特异性的对应关系，以真阳性率(敏感性)为纵坐标，假阳性率(100-特异性)为横坐标，绘制ROC曲线，曲线上的每一个点分别代表该PI值所对应的敏感性和特异性。以ROC曲线下面积值(AUC)为评判标准，评价诊断方法的准确性。[0140]在AUC>0.5的情况下，AUC越接近1,说明诊断效果越好，AUC在0.5-0.7时有较低的[0141]当临界值为24.72%时，此时诊断敏感性为93.33%;诊断特异性为93.33%;ROC曲线下面积为0.9856,说明该试剂盒具有较高的准确性(图9)。为方便试剂盒的结果判定，取整数25%作为临界值。最终将阻断率25%确定为本发明的试剂盒的临界值，即试剂盒的判定条件：当阻断率值小于25%,该样品判定为BVDV中和抗体阴性。当PI值大于或等于25%,该样品[0142]实施例4.基于阻断ELISA法的BVDV抗体检测试剂盒的性能检验采用实施例3制备的基于阻断ELISA法的BVDV抗体检测试剂盒(简称本发明的试剂盒)检测28份BVDV抗体弱阳性血清。结果如表12所示，28份血清样品PI值都在25%～35%之间，试剂盒与中和试验的阳性符合率为100%。和1:8的血清，作为BVDV抗体弱阳性血清。表12本发明的试剂盒对28份弱阳性血清的检测结果血清编号中和试验血清编号中和试验效价S/N值效价123456789分别采用中和试验、本发明的试剂盒以及美国爱德士公司的IDEXX牛病毒性腹泻病毒抗体检测试剂盒(简称为IDEXX试剂盒)对218份牛病毒性腹泻病灭活疫苗免疫血清样品进行检测。本发明的试剂盒的操作步骤参照实施例3,IDEXX试剂盒的操作步骤参照试剂盒说明书。[0146]结果显示，在218份血清中，中和试验的检测结果为BVDV抗体阳性的血清148份，BVDV抗体阴性的血清70份。本发明的试剂盒的检测结果为BVDV抗体阳性的血清151份，BVDV性