实验五-人类染色体标本制备

1、实验五人类染色体标本制备【目的要求】1 .熟悉人外周血淋巴细胞培养的原理。2 .初步掌握人类外周血淋巴细胞染色体标本的制备方法。3 . 了解正常人非显带染色体核型特征及核型分析方法。 【实验原理】人类间期细胞核中的遗传物质染色质，在细胞进入分裂期时，经逐级螺旋形成染色体。 在分裂期的中期，染色体达到最大程度的凝集，表现为短而粗的典型结构。人外周血的有形成分中，只有白细胞有核，而白细胞中只有淋巴细胞（主要是小淋巴细胞）具有潜在的细胞分裂能力。培养液中加入有丝分裂刺激剂植物血凝素（pha）可使处于g0期、具有潜在分裂能力的淋巴细胞转化为具有分裂能力的淋巴母细胞，并进入旺盛的有丝分裂周期；加入纺锤体

2、抑制剂秋水仙素可使处于分裂过程的淋巴细胞停滞在分裂中期，在收获细胞时，用低渗剂0.075mol/l kcl对细胞进行低渗处理，可使胞膜胀破，染色体均匀分散；经离心、固定、制片等 过程，最终可获得便于观察分析的染色体标本。制备的染色体标本片，不经特殊处理，直接染色，在显微镜下观察识别，并进行核型分析的过程称为染色体非显带核型分析。【实验用品】（一）材料：人外周静脉血。（二）器材：吸管、刻度离心管、量筒、 5ml注射器、6号针头、台式离心机、试管架、 冷藏载玻片（一端磨砂）、铅笔、酒精灯、超净工作台、恒温水浴箱、载玻片、止血带、酒 精棉球、显微镜、废液缸。（三）试剂1. rpmi1640 培养液（

3、1） rpmi1640 : rpmi1640固体培养基10.4 g,溶于1000 ml双蒸水中，抽滤除菌。（2） rpmi1640 培养液：每100 ml rpmi1640 培养液中含 rpmi 1640 80 ml 、灭活的小 牛血清20 ml、pha 50 mg、青霉素（终浓度100 u/ml）、链霉素10000 闻（终浓度100科 g /ml） , 15磅、20min高压灭菌的nahco 3调ph至7.27.4 ,分装20小瓶，每瓶5 ml。（3）配制方法配制过程所需的玻璃器具先用浅水洗刷干净，烘干，放入清洁液中浸泡2 d,取出后用自来水冲洗15次，蒸储水冲洗3次，双蒸水冲洗1次，烤干后

4、包装，15磅20 min高压灭菌。新瓶塞等橡胶类制品用水洗刷后，用0.5mol/l naoh 煮沸20min ,自来水冲洗；用0.5mol/l hcl 煮?u 20 min，自来水冲洗，蒸储水冲洗，在双蒸水中浸泡24h ;浸泡后取出晾 干，包装后高压灭菌。使用过的橡胶制品用肥皂液洗后，再用自来水，蒸储水、双蒸水冲洗， 晾干包装后高压灭菌。无菌室用紫外灯消毒 2h o进入无菌室前用肥皂彻底洗手，双手在新洁而灭溶液中浸泡20min ,然后穿隔离衣，戴口罩、帽子，进入无菌室操作时，再用75 %酒精擦手。在无菌室内，将rpmi 1640粉剂10.4 g ,溶于1000 ml双蒸水中，(rpmi1640

5、粉剂较难 溶，可用酒精灯微火稍加热，或通入co2使ph降至6.0左右可溶解)。液体呈透明状说明已完全溶解，倒入细菌滤器中过滤除菌。在无菌室的超净工作台内，取适量已抽滤的 rpmi1640加入成比例的灭活小牛血清、pha、 青霉素和链霉素，混匀，用经过 15磅20 min高压灭菌的5% nahco 3调至ph7.2 ,分装成 每瓶5 ml ,冰冻保存。已除菌过滤、未分装的 rpmi1640也需冷冻保存。2.无菌肝素(500 u/ml ):肝素注射液1支2 ml (含12500 u ),加23 ml无菌生理 盐水混匀(或肝素粉剂，用时配成 0.2%肝素液)，经8磅15 min高压灭菌，置4c冰箱保

6、存 备用。（3） .其他试剂：0.01%秋水仙素、0.075 mol/l kcl 低渗液、carnoy固定液、10% giemsa 染液。【实验操作】(一)染色体标本制备1 .取材培养(1)采血：用无菌注射器吸取约 0.2 ml肝素液，来回抽动针筒，使肝素湿润针筒，戴上 针头套；彻底消毒采血处皮肤，抽取静脉血约 2 ml ,戴上针头套，转动针筒，使肝素与血 液混匀，防止血液凝固(采血过程中严格执行无菌操作)。在超净工作台内，去掉针头套，用无菌棉球擦除针头上的血迹；用酒精棉球消毒盛有5ml培养液的培养瓶瓶塞，并将瓶塞在酒精灯火焰上过一下；在酒精灯火焰旁，将采血的注 射器针头经培养瓶皮塞插入培养瓶

7、中，每瓶接种血液约0.3 ml ,轻轻摇匀。(2)培养：培养瓶置37 c恒温箱中培养，当培养至68 h ,取出培养瓶，在超净工作台内， 用注射器(5号针头)向培养瓶中加入0.01%秋水彳01素1滴，轻轻摇匀，放回37 c恒温箱继续培 养至72 h。2 .气干法制片(1)收集细胞：将培养瓶中的培养物用吸管移入刻度离心管内，离心810 min (1000r/min ),弃上清液，为防沉淀物中细胞丢失，可适当留点上清液。(2)低渗：向离心管中加6m1预温37 c的0.075 mol/l kcl低渗液，用吸管向离心管底 部充气，轻轻将细胞沉淀冲散打匀，离心管放入37 c水浴箱中低渗处理15 min。(3)预固定：低渗处理后，加 carnoy固定液约0.51 ml ,用吸管轻轻冲打混匀，预固 定；然后离心810 min(1000 r/min) ,弃上清液。预固定可防止细胞在固定时集聚成块。(4) 固定：在沉淀物中加carnoy 固定液 5 m1 ，用吸管将沉淀物轻轻冲打均匀，室温下静置固定20 min ,离心810 min(1000r/min),弃上清液。固定有利于染色体在载玻片上 展开，保持染色体结构完整；如固定不充分，则染色体形象模糊，染