土壤中分解尿素的细菌的分离与计数公开课

1、整理ppt1 专题专题2 :2 :微生物的培养与应用微生物的培养与应用 课题课题2 土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的 分离与计数分离与计数 整理ppt2 课题背景课题背景 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农作物被农作物吸收。吸收。 土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之后才能被植物利用。之后才能被植物利用。 2、细菌能利用尿素的原因、细菌能利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶 CO(NH2)2 脲酶脲酶 + H2O+ CO22NH3

2、整理ppt3 3、常见的分解尿素的微生物、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭 状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。 4、课题目的、课题目的 从土壤中分离出从土壤中分离出能够分解尿素的细菌能够分解尿素的细菌 统计统计每克土壤每克土壤样品中究竟含有样品中究竟含有多少这样的细菌多少这样的细菌 研究思路研究思路 .筛选菌株筛选菌株 .统计菌落数目统计菌落数目 .设置对照设置对照 整理ppt4 1、实例：、实例： PCR技术技术 启示：寻找启示：寻找目的菌种目的菌

3、种时要根据它对生存环境的要求，到时要根据它对生存环境的要求，到相应的相应的 环境环境中去寻找。中去寻找。 原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度70800C，淘汰了绝大多数微生物只有，淘汰了绝大多数微生物只有 Taq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。 DNA多聚酶多聚酶链式反应链式反应是一种在是一种在 体外将少量体外将少量DNA大量复制大量复制(PCR) 的技术，此项技术要求使用的技术，此项技术要求使用耐高耐高 温（温（930C）的）的DNA聚合酶。聚合酶。 .筛选菌株筛选菌株 整理ppt5 要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、包括营养、

4、生理、生长条件等；生理、生长条件等； 方法：方法： 抑制大多数微生物的生长抑制大多数微生物的生长 促进促进目的菌株目的菌株的生长的生长 结果：结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等 方法对它进行纯化培养分离。方法对它进行纯化培养分离。 2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理： 人为提供有利于人为提供有利于目的菌株目的菌株生长的条件生长的条件(包括营养、温度、包括营养、温度、 pH等等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。，同时抑制或阻止其他微生物生长。 整理ppt6 15.0g琼脂琼脂 1.0g尿素尿素 10.0g葡萄糖

5、葡萄糖 0.2gMgSO47H2O 2.1gNaH2PO4 1.4gKH2PO4 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基： 从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？ 固体培养基固体培养基 整理ppt7 在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 碳源：碳源：葡萄糖葡萄糖 氮源：氮源：尿素尿素 培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶 的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮 源。源。缺乏缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿脲酶的微生物由于不能分解尿

6、素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而 受到抑制，所以用此培养基就能够选择受到抑制，所以用此培养基就能够选择 出分解尿素的微生物。出分解尿素的微生物。 4、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理 整理ppt8 允许允许特定种类特定种类的微生物生长，同时的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类抑制或阻止其他种类微生微生 物生长的培养基，叫做物生长的培养基，叫做选择培养基选择培养基 整理ppt9 5、怎样证明此培养基具有选择性呢？、怎样证明此培养基具有选择性呢？ 以尿素为以尿素为 唯一氮源唯一氮源 的培养基的培养基 牛肉膏牛肉膏 蛋白胨蛋白胨

7、培养基培养基 是是 分离分离 尿素尿素 细菌细菌 判断该判断该 培养基培养基 有无选有无选 择性择性 实验组实验组 对照组对照组 培养基类型培养基类型 是否是否 接种接种 目的目的 结果结果 只生长尿只生长尿 素细菌素细菌 生长多种生长多种 微生物微生物 是是 整理ppt10 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数： 利用利用血球计数板血球计数板(血细胞计数板血细胞计数板），在显微镜下计算一定，在显微镜下计算一定 容积里样品中微生物的数量。容积里样品中微生物的数量。 .统计菌落数目：统计菌落数目： 不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数； 需要相

8、对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察； 缺点：缺点： 整理ppt11 2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法） 原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所 形成的形成的一个菌落一个菌落是由是由一个单细胞一个单细胞繁殖而成的，即繁殖而成的，即一个一个 菌落代表原先的一个单细胞。菌落代表原先的一个单细胞。 常用方法：常用方法：稀释涂布平板法稀释涂布平板法。 每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(CV)M 其中，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，代表某一稀释度

9、下平板上生长的平均菌落数，V代代 表涂布平板时所用的稀释液的体积表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。代表稀释倍数。 整理ppt12 ？ 说明设置重复组的重要性。说明设置重复组的重要性。在设计实验时，一定要涂布至少在设计实验时，一定要涂布至少3 个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结。在分析实验结 果时，果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味 着操作有误，需要重新实验着操作有误，需要重新实验。 整理ppt13 注意事项注意事项

10、 为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平的平 板上进行计数。板上进行计数。 为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以同一稀释度加到三个或三个以 上的平板中上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。，经涂布，培养计算出菌落平均数。 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。 整理ppt14 实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时， A同学从对应的同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，个

11、菌落， 但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析个菌落。分析 其原因。其原因。 土样不同土样不同 培养基污染或操作失误培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质或者是混入了其他的含氮物质) 小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是 必不可少的。必不可少的。 假设一：假设一：由其他同学由其他同学用与用与A同学相同土样同学相同土样进行实验进行实验 假设二：假设二：将将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白同学配制的培养基在不加土样的情况下进行

12、培养，作为空白 对照，以证明培养基是否受到污染。对照，以证明培养基是否受到污染。 结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则无误；如果结果不同，则 证明证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。同学存在操作失误或培养基的配制有问题。 如何如何 验证验证? 整理ppt15 （三）设置对照（三）设置对照 判断培养基中是否有杂菌污染：判断培养基中是否有杂菌污染： 将未接种的培养基同时进行培养。将未接种的培养基同时进行培养。 判断选择培养基是否具有筛选作用：判断选择培养基是否具有筛选作用： 完全培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落数目。完全

13、培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落数目。 主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响， 提高实验结果的可信度。提高实验结果的可信度。 整理ppt16 从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土3 cm 左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 “微生物的天然培养基微生物的天然培养基” 一一土壤取样土壤取样 数量最大、种类最多数量最大、种类最多 大约大约70%90%是细菌是细菌 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌

14、。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 整理ppt17 二二制备培养基制备培养基 由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较 为宽泛的范围：为宽泛的范围：稀释倍数为稀释倍数为103107。 可准备可准备牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基和和选择培养基。选择培养基。每个稀释度下需要每个稀释度下需要3 个选择培养基，个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。个牛肉膏蛋白胨培养基。 将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落 数目应明显数目应明显多于多于选择

15、培养基上的数目，因此，选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基 可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择选择作用。作用。 整理ppt18 应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g。 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行 分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板之间、适于计数的平板 （三）（三）样品的稀释样

16、品的稀释 整理ppt19 问题：问题：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土 壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用 的稀释范围相同吗？的稀释范围相同吗？ 原因：原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同）是不同 的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌 数约为数约为2 185万，放线菌数约为万，放线菌数约为477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.1万。万。 结论

17、：结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度 进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。 整理ppt20 .取样涂布取样涂布 实验时要对培养皿作实验时要对培养皿作 好标记。注明培养基类好标记。注明培养基类 型、培养时间、稀释度、型、培养时间、稀释度、 培养物等。培养物等。 如果得到了如果得到了至少至少2个个菌落数目在菌落数目在30300的平板，则说明稀释的平板，则说明稀释 操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三同一稀释倍数的三

18、个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。，需要重新实验。 整理ppt21 .微生物的培养与观察微生物的培养与观察 在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不以防止因培养时间不 足而导致遗漏菌落的数目。足而导致遗漏菌落的数目。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：细菌：3037培养培养12d 放线菌：放线菌：2528培养培养57d 霉菌：霉菌：2528的温度下培养的温度下培养34d。 整理ppt22 微生物的培养与观察微生物的培养与观察 菌落的形状、大小、菌落的形状、大小、 隆起程度和颜色隆起程度和颜色 整理ppt23 整理ppt24 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥 形瓶中，塞好棉塞。形瓶中，塞好棉塞。 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。、在稀释土壤