水稻VDAC和ANT基因家族表达研究

1、中南民族大学硕士学位论文水稻VDAC和ANT基因家族表达研究姓名：马亢申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：刘学群;王春台20090610水稻 VDAC 和 ANT 基因家族表达研究摘要本研究对研究室前期预测的潜在的水稻8个vdac位点和3个ant位点的定位进行验证，在此基础上研究定位的vdac和ant基因在粳稻品种日本晴、籼稻同核异质系YTA和YTB中的表达，及vdac和ant基因在野生稻和栽培稻(非洲栽培稻、斑点野生稻、非洲野生稻、药用野生稻、高杆野生稻、宽叶野生稻、日本晴、红莲型水稻YTA、红莲型水稻YTB)中的分布，主要取得了以下结果：(1) 验证了预测的vdac和an

2、t潜在的基因位点的正确性以本研究室通过生物信息学手段预测的水稻vdac和ant基因位点为基础，根据水稻日本晴基因组序列，设计扩增目的基因的特异引物；通过对水稻日本晴基因组DNA的PCR扩增和目的片段的克隆测序，验证了预测的水稻vdac和ant基因位点的正确性。(2) vdac和ant在日本晴、YTA、YTB幼苗中的表达分析：RT-PCR分析表明，所有预测的8个vdac和3个ant基因在粳稻品种日本晴及籼稻同核异质系YTA和YTB幼苗的根、茎、叶中均表达。实时荧光定量PCR对vdac和ant基因成员在日本晴、YTA和YTB幼苗的根、茎、叶中的表达差异进行了初步分析，结果表明，在3个ant基因中，

3、ant1, ant2的表达高，而ant3表达很低。在8个vdac中vdac8表达最高，vdac1, 2, 7表达也较高，而vdac3, vdac5表达很低。vdac和ant基因家族各成员在不同品种幼苗根、茎和叶中的表达模式不同。粳稻(日本晴)与籼稻(YTA和YTB)之间的表达差异大于籼稻内不同品种之间的差异。同核异质系YTA和YTB幼苗中表达模式的差异可能与不同细胞质对核基因的表达调控有关。(3) vdac、ant 基因家族在 O. officinalis 相似群中的分布：分别以 O. officinalis 相似群的 6 个不同野生稻种(BB、CC、BBCC 及 CCDD 基因组)和 2 个

4、栽培稻种(AA 基因组，1 个非洲栽培稻品种和 3 个亚洲栽培稻品种)的基因组 DNA 为模板扩增 vdac 和 ant 基因特异片段。所有特异引物均能扩增出预期大小的特异条带，但不同在供试材料中基因组之间扩增出 vdac、ant 家族成员的数目具有一定的差异。AA、BB、CC 基因组具有 vdac1、4、7、8 和 ant1 引物的扩增位点，而 DD 基因组则不能确定。只有 AA 基因组具有 vdac6 引物的扩增位点。ant3在所有栽培稻及二倍体斑点野生稻(BB)中能扩增出特异条带。基因组 AA、BB、DD具有 vdac2 引物的扩增位点。在具有 CCDD 基因组的高秆野生稻中能扩增出 v

5、dac5IV中南民族大学硕士学位论文和 ant2 的特异片段，但在具有 CCDD 基因组的宽叶野生稻(CCDD)中未能扩增出vdac5 和 ant2 的特异片段，这暗示来源于拉丁美洲的多年生高秆野生稻和宽叶野生稻稻种之间的存在明显差异。本研究对预测的 8 个潜在的水稻 vdac 位点和 3 个 ant 位点的验证，为克隆其中重要的一些基因提供了依据；对这些基因的表达分析为其功能研究奠定了一定的基础；对 vdac、ant 基因家族在稻属 O. officinalis 相似群中的分布的分析，为研究水稻vdac 和 ant 基因家族成员之间的进化关系提供了佐证。关键词：水稻；荧光定量 PCR；O.

6、officinalis 相似群；电压依赖性阴离子通道(VDAC)；腺苷酸转运蛋白(ANT)V水稻 VDAC 和 ANT 基因家族表达研究AbstractIn this article, three potential ant and eight potential vdac gene sites, forecasted by our laboratory earlier, in rice genome were conformed, the expression of all of them in japonica rice, Nipponbare, and in indica rice, h

7、onglian cytoplasmic sterile rice YTA and YTB, and their distribution in wild rice and cultivated rice (O. sativa, AA; O. glaberrima, AA; O. officinalis, CC; O. punctata, BB, BBCC; O. punctata, BBCC; O. schweinfurthiana, BBCC; O. alta, CCDD; O. latifolia, CCDD) were analyzed. The major results as fol

8、lows:(1) The three potential ant and eight potential vdac genes conformedBased on the potential ant and vdac gene sites forecasted by our laboratory using bioinformatics, the specific primers for the potential gene sites were designed for amplifying the sequence from rice genome DNA by PCR. By the s

9、equence analysis of amplified DNA fragments, all the potential forecasted gene sites in rice genome were conformed.(2) The expressions of vdac and ant genes in seedlings of Nipponbare, YTA and YTB RT-PCR showed that all of the three potential ant and eight potential vdac genes expressed inthe leaf,

10、root and stem of Nipponbare, YTA and YTB seedlings. Real-time quantitative PCR showed that ant1 and ant2 perform a high level of expression than that of ant3, and the vdac8 has the highest expression among the eight vdacs, the expressions of vdac1, 2, 7 are a little higher than those of vdac3, 4, 5

11、in the tissues of three rice seedlings.The real-time quantitative PCR analysis also showed that the expressions of most of the genes tested in seedlings of japonica rice Nipponbare are higher than those in indica rice, YTA and YTB, and the expressions of ant and vdac genes varied between honglian cy

12、toplasmic sterile line, YTA, and their maintenaner line, YTB, indicating the nuclear gene expression could be affected by their cytoplasms.(3) The distribution of the three ant genes and eight vdac genes in O. officinalis similar group Six wild rice (BB, CC, BBCC, CCDD) and two cultivar rice (AA) ge

13、nome DNAs in O.officinalis similar group were used for studying the distribution of the three ant genes and eight vdac genes by comparing the amplified bands with their specific primers. The results showed that vdac1, 4, 7, 8 and ant1 genes, which could not detected in DD genome, existed in AA, BB a

14、nd CC genome, vdac6 gene existed only in AA genome, vdac2 gene presented in AA, BB and DD genome. vdac5 and ant2 genes cloud amplify in O.alta but not in O.latifolia, though they both were classified as CCDDVI中南民族大学硕士学位论文genome, indicating the wild rice, O.latifolia and O.alta from Latin Amercian mi

15、ght be different.In this study, the confirmation of the three potential ant and eight potential vdac genes would be very useful for their cloning later; the expression analysis of these genes may provide some speculation for their physiological functions in rice growth and development; the distribut

16、ion analysis of the three ant and eight vdac genes in O. officinalis similar group may provides very information for characterizing their evolution relationship.Key words: Rice; real-time PCR; O. officinalis similar group; VDAC; ANTVII水稻 VDAC 和 ANT 基因家族表达研究英文缩略语及英文对照VDACVoltage Dependent Anion Chann

17、elANTAdenine Nucleotide TranslocatorMPTMitochondrial Permeability TransitionPTPPermeability Trasition PorecDNAcomplementary DNACTABHexadeyltrimethyl ammomum bromideddH2ODouble distilled waterDEPCDieyhyl pyrocarbonatedNTPsDeoxyribonucleoside triphosphatedsRNAdouble strand RNAE.coliEschericia coliEBEt

18、hdium bromideEDTADidodium ethylenediaminetetra-acetateIPTGIsopropyl -D-thiogalactosidekbKilobaseLBLuria brothmgMilligramminMinutemLMillilitremolMolarngNanogramODOptical densityPCRPolymerase chain reactionRNARibonucleic acidRNaseRibonucleaserpmRevolutions per minuteSDSSodium dodecyl sulfatesecSecondT

19、aqThermus aquaticus DNA polymerase电压依赖性阴离子通道腺苷酸转运酶线粒体渗透性转换渗透性转换孔互补 DNA十六烷基三甲基溴化铵双蒸水二乙基焦碳酸盐脱氧核糖核苷三磷酸(4 种)双链 RNA大肠杆菌溴化乙啶乙二胺四乙酸异丙基-D-硫代半乳糖苷千碱基LB 培养基毫克分钟毫升摩尔纳克光密度聚合酶链式反应核糖核酸核糖核酸酶每分钟转速十二烷基磺酸钠秒钟嗜热水生菌 DNA 聚合酶VIII中南民族大学硕士学位论文TrisTris(hydroxymethyl) aminomethane三羟基甲基氨基甲烷UUnit单位gMicrogram微克LMicrolitre微升IX中南民族

20、大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：日期：2008 年 6 月 10 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权中南民族大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描

21、等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密，在_年解密后适用本授权书。2、不保密。（请在以上相应方框内打“”）作者签名：导师签名：日期：日期：年 月年 月日日中南民族大学硕士学位论文第一章 文献综述线粒体是1850年发现，1898年命名的。在电镜下线粒体是由两层单位膜套叠而成的封闭的囊状结构，主要由外膜、内膜、膜间隙及基质四部分组成。基质内含有三羧酸循环所需的全部酶类，内膜上具有呼吸链酶系及ATP酶复合体。线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所，有细胞“动力工厂”之称。线粒体有自身的DNA和遗传体系, 但线粒体基因组的基因数量有限，因此，线粒体只是一种半自主性的细胞器。线粒

22、体与核基因组的协同作用，在调节生物的生长、发育、衰老、死亡等方面均具有重要的作用。20世纪70年代中后期，在研究哺乳动物细胞线粒体功能时，发现了线粒体渗透性转换(Mitochondrial Permeability Transition, MPT)现象，即线粒体渗透性的变化与线粒体膜上的一类孔的开闭密切相关(Hunter et al., 1976; Hunter and Haworth, 1979a;Hunter and Haworth, 1979b)。当线粒体膜上的这类孔开启时，分子量小于约1.5 KD的游离物质均可通过内膜，引起线粒体膨胀、内外膜电势(m)消失、氧化磷酸化与电子流解偶联，这

23、类孔称之为渗透性转换孔(Permeability Trasition Pore, PTP)。由PTP的开闭引起的MPT是一个复杂的过程，但MPT的发生最明显的特征是需要钙离子(Ca2+)在线粒体基质中积累。环孢菌素A(CsA)对哺乳动物的MPT的发生表现为特征性的抑制。PTP是由多蛋白组成的、跨线粒体双层膜的超分子复合物，其核心有基质中的亲环蛋白D(CyP-D)、内膜上的腺苷酸转运蛋白(ANT)和外膜上的电压依赖性阴离子通道(VDAC)蛋白(Crompton et al., 2002; Halestrap and Brennerb, 2003)。另外，位于膜间隙的肌酸激酶(CK)(Vyssok

24、ikh and Brdiczka, 2004)、外膜上的表面苯并二氮受体 (Obame et al., 2007)、与VDAC相结合的己糖激酶(HK)(Abu-Hamad et al., 2008)等也参与了这个复合体的构成。1.1 VDAC 基因的表达及其功能1.1.1 VDAC 的结构1976年，Schein发现线粒体外膜上一种孔蛋白与革兰氏阴性菌膜蛋白Porin具有很高的相似性(Schein et al., 1976)。随后的研究证明，这种孔蛋白是线粒体外膜上的1水稻 VDAC 和 ANT 基因家族表达研究主要成分之一，构成了膜上的电压依赖性阴离子通道(VDAC)(Zalman et a

25、l., 1980)。图 1-1 水稻VDAC的拓扑模型Fig. 1-1 The topological model of rice VDAC. A horizontal cylinder is used for the -helix left and vertical cylinders for -strands. Putative phosphorylation sites for casein kinase II (CK2) and protein kinase C (PKC) are indicated by dark grey and light grey ovals, respect

26、ively. Circles show the putative phosphorylated residues(Al Bitar et al., 2003)VDAC蛋白由13-18个反平行的折叠和一个螺旋组成3-D的桶状结构(Casadio et al., 2002)。在VDAC中，所有的链都是跨膜的(Abrecht et al., 2000)，基于VDAC蛋白的氨基酸序列的功能预测，水稻VDAC蛋白的蛋白磷酸激酶C(PKC)和肌酸激酶2(CK2)的磷酸化基序均在链之间的2个Loop上(图1-1，Al Bitar et al., 2003)。小鼠VDAC1的N末端存在一个核苷酸结合位点(N-

27、terminal nucleotide-binding site, NBS)，对此位点的定点诱变会改变VDAC1转运代谢产物和腺嘌呤核苷酸的通道活性。推测VDAC1-NBS可能与线粒体ATP合成、细胞生长与成活有关(Yehezkel et al., 2007)。另外，通过光敏性叠氮化钌(Photoreactive azido ruthenium, AzRu)与VDAC上Ca2+结合位点的专一性结合实验表明，VDAC钙离子的结合位点定位在VDAC的含E72和E202的两个多肽顺序上；根据预测的VDAC1拓扑结构模型，VDAC的这两段多肽顺序在胞质侧形成2个明显不同的loop(Israelson

28、et al., 2007)。2中南民族大学硕士学位论文图 1-2 预测的真核生物VDAC三维立体模型Fig. 1-2 Hypothetical 3-D model of an eukaryotic VDAC1 using Neurospor crassa (Casadio et al.,2002)实验证明，单个VDAC通道可由一个含285个氨基酸残基的蛋白(30 KD)构成。这个通道能形成一个电压孔(开孔状态直径3 nm，闭孔状态直径1.8 nm，Figure 1-2)，该孔随着不同的选择性和渗透性变化有多种构象形式。VDAC通道能运输腺嘌呤核苷、Ca2+和其他代谢物，没有离子特异性(Colo

29、mbini et al., 1987)。1.1.2 VDAC 基因的表达VDAC 由一个小的多基因家族编码(Young et al., 2007)。VDAC 编码基因已在几个真核生物中被克隆。 在哺乳动物中，已经证明具有 3 个 VDAC 异构体 (Blachly-Dyson et al., 1993; Sampson et al., 1997; Rahmani et al., 1998)，编码这 3 个 VDAC 异构体的基因具有高度相似的组织形式，外显子内含子之间的界点是保守的，差异集中在 mRNA 5和 3非编码区，启动子区富含 G+C，不含任何经典的 TATA box元件。这两点是组成

30、型表达相关的管家基因的特性。哺乳动物的 3 个 VDAC 基因的表达也具有一定的组织特异性：在小鼠中，mvdac2 在睾丸中是高表达的(Sampson etal., 1996)，而 mvdac1 在该组织中不表达；人 hvdac3 和小鼠 mvdac3 都在睾丸中广泛分布并表达特别高(Rahmani et al., 1998)。在高等植物中，豌豆的 VDAC 只存在于非绿色质体中，与拟南芥中存在的 5种 VDAC 同源异构体对比发现，两者 VDAC 有 50-85%的序列同源性(Clausen et al., 2004)。免疫杂交分析表明，豌豆 VDAC 基因在根和叶中都有表达，在根中的表达水

31、平要高，这与小麦的一致(Elkeles et al., 1995)。水稻(Oryza sativa)中已知的 3 个 vdac基因在不同的组织中的表达方式不同，osvdac2 是组成型表达的，而 osvdac1 和3水稻 VDAC 和 ANT 基因家族表达研究osvdac3 则是差异表达的。osvdac3 在花中较高表达被认为与花器官中线粒体活性较高有关(Al Bitar et al., 2003)；所有的 VDAC 异构体的表达水平在植物授粉前明显高于授粉后；另外，在水稻中 osvdac1 基因的表达不受渗透胁迫的影响(Roosens et al.,2000)。尽管在植物、动物及真菌中发现的

32、所有具有相似通道活性的VDAC蛋白，其一级结构的氨基酸序列的一致性都较低(50%)，但其二级结构基序是高度保守的(Abrecht et al., 2000)。1.1.3 VDAC 在细胞内的定位及生理功能VDAC是线粒体外膜中含量最丰富的蛋白，最初认为VDAC只定位于线粒体外膜上。1989 年，首次报道了VDAC(Porin 31HL) 被定在线粒体外的B 淋巴细胞膜上 (Thinnes et al., 1989)。之后的一些研究还表明，VDAC也定位在其他细胞部分，如核膜内陷(Thinnes, 1992)和类似膜内陷区域(Bathori et al., 1999)、肌质网(Shafir et

33、 al., 1998)、高尔基体和内质网(Okada et al., 2004)、内涵体(Reymann et al., 1998)、鼠脑和星细胞的突触前囊泡(Guibert et al., 1998)、精子鞭毛的外致密纤维(ODF)(Hinsch et al., 2004)和顶体中(Triphan et al., 2008)。有研究表明，哺乳类动物细胞线粒体上最丰富的VDAC 异构体是VDAC1(Yamamoto et al., 2006) ；此前广泛认为质膜上的maxianion通道(pl-VDAC)并不是VDAC(Sabirov et al., 2006)；免疫学检验显示，VDAC可能存

34、在更多的异构体，VDAC的定位具有组织特异性(Cesar Mde and Wilson, 2004)。定位在不同的细胞器的VDAC的功能有一定差异，定位在线粒体的VDAC参与了线粒体内外代谢物流的调节，生理功能也是多样性。线粒体VDAC与ANT形成复合体，能与一些细胞质激酶和其他一些蛋白结合，促进线粒体高能磷酸化合物运输到细胞质；促进线粒体细胞色素C的释放，介导细胞凋亡或程序性死亡(Crompton et al., 2002)。VDAC能和细胞骨架蛋白如MAP2(微管相关蛋白)、动力蛋白轻链和G-actin整合在一起(Linden and Karlsson, 1996; Krimmer et

35、al., 2001; Xu et al., 2001; Schwarzer et al., 2002)，可能参与了线粒体运动或细胞运动(Roman et al., 2006)。动物中 3 个不同异构体的存在及其不同的表达形式表明他们各自具有特异的功能。在酵母中表达的小鼠重组 VDAC 蛋白可以用来重构 VDAC 脂质体，研究其门控活性。纯化的 VDAC 蛋白的电生物学研究显示，不同异构体之间具有不同的特性。4中南民族大学硕士学位论文VDAC1 和 VDAC2 很容易插入脂质体并在磷脂膜内形成通道。VDAC2 可以两个不同的群体出现，一个拥有正常的门控活性，另一个拥有低的电导率和选择性。VDAC

36、3也能在脂质体上形成通道，但不能很好地插入膜中，通常即使在很高的膜电位也不能有效地表现出门控效应(Xu et al., 1999)。这些差异表明 VDAC 异构体可能具有独特的生理学功能。在小鼠胚胎干细胞的研究中发现，缺失任一VDAC异构体的细胞均可存活，但耗氧量减少了30%。在缺失VDAC1和VDAC2但VDAC3表达正常的细胞中细胞色素C氧化酶活性降低，这表明不是所有的VDAC异构体对细胞生存都是必需的(Wu et al.,1999)。缺失mVDAC1的小鼠，呈现出一定的致死率和呼吸缺陷性；缺失mVDAC3的小鼠可以存活，但是生长迟缓(Weeber et al., 2002)，mVDAC3

37、缺失的雄性是不育的而雌性是可育的(Sampson et al., 2001)。果蝇的VDAC缺失也可能造成果蝇的雄性不育(Graham and Craigen, 2005)。有研究表明，线粒体VDAC1能与决定雄性性别分化的对类固醇产生敏感的调节蛋白(StAR)相互作用，参与孕烯醇酮的合成(Bose et al.,2008)。这些结果暗示，VDAC可能参与了动物性别决定与育性。1.1.4 VDAC 在细胞凋亡中的作用VDAC与细胞凋亡关系的研究尚无一致性的结论。一般认为，能够触发caspase凋亡级联反应(Bernardi et al., 2001)。通过转录一个短发夹 RNA(shRNA)的

38、载体沉默内源性 VDAC 基因表达的方法，探讨 VDAC 在调节细胞生长中的作用的研究结果表明，shRNA 能够有效的下调人T-REx-293 细胞中的 hVDAC1，但是对鼠的 mVDAC1 没有作用。下调表达 hVDAC1的细胞 ATP 合成能力降低了 4 倍，生长速率下降了 90%。高浓度的四环素诱导的 mVDAC1 过表达，能诱发细胞死亡。通过抑制内源性 hVDAC1 表达和引入正常和变异的 mVDAC1 的方法进一步研究 VDAC1 在细胞凋亡中的作用表明，在抑制表达hVDAC1、正常表达 mVDAC1 或 E72Q 变异的 mVDAC1(E72Q-mVDAC1)的两种细胞中，观察到

39、细胞凋亡；表达正常 mVDAC1 的无 hVDAC1 细胞中，诱发的细胞凋亡能够被钌红所抑制，在表达变异 mVDAC1(E72Q-mVDAC1)的无 hVDAC1 细胞中则不能被抑制(Abu-Hamad et al., 2006)。VDAC2 被认为与调节细胞凋亡的前凋亡蛋白 BAK 相互作用，能阻止其后者的活性(Cheng et al., 2003)，在癌症的研究中发现5水稻 VDAC 和 ANT 基因家族表达研究的 erastin(一种小分子的抗癌药物)能直接与 VDAC2 结合，可诱发一种非凋亡型细胞死亡(Yagoda et al., 2007)。己糖激酶-I 降低了小鼠 VDAC1(m

40、VDAC1)的通道电导性，抑制了 Cyt C 的释放进而抑制了细胞凋亡(Abu-Hamad et al., 2008)。RuR 能够通过与VDAC1 相互作用抑制 Cyt C 的释放，也抑制由 Cyt C 诱导的细胞死亡(Israelson et al.,2008)。但是，在小鼠的 vdac 敲除研究则表明，缺失单独 vdac1、vdac3 和同时缺失 vdac1和 vdac3 的小鼠在钙离子和氧胁迫诱导的 MPT，与野生型几乎没有区别。同样，在3 个 vdac 中，单基因缺失、vdac1 和 vdac3 同时缺失以及 3 个基因同时缺失的纤维原细胞，钙离子和过氧胁迫诱导的 MPT 和细胞死亡

41、与野生型相比也没有变化。野生型和 VDAC 缺失的线粒体和细胞在响应前凋亡蛋白 Bcl-2 家族成员 Bax 和 Bid 时的反应(Cyt C 的释放和 caspase 变构和细胞死亡)也相同。这些结果表明 VDAC 在 MPT和 Bcl-2 家族成员诱导的细胞死亡中并不是不可或缺的(Baines et al., 2007)。VDAC细胞凋亡的调控作用很可能是组织特异性和不同VDAC异构体是针对不同诱导信号的，因此，VDAC的不同异构体扮演了不同的角色。1.2 ANT 基因的表达及其功能1.2.1 ANT 的结构腺苷酸转移酶(adenine nucleotide translocase，ANT

42、，亦称为 ADP/ATP carriers，AACs)是线粒体中最丰富的蛋白质之一。在能量消耗大的组织中，例如，心脏中的含量是 1.2 nmol/mg 线粒体蛋白，占线粒体内膜蛋白的 10%，肝脏中的含量是 0.4nmol/mg 线粒体蛋白(Klingenberg, 1980; Fiore et al., 1998)。从植物中分离纯化出的ANT 单链蛋白分子质量大约为 33 KD (Genchi et al., 1996; Spagnoletta et al., 2002)。ANT 定位于线粒体内膜上，但免疫组织化学研究表明 ANT 也定位于某6中南民族大学硕士学位论文图 1- 3 ANT的结

43、构模型。图a, ANT二级结构示意图，分别用H, h, C, M表示跨膜螺旋、表面螺旋、位于膜内的loop和位于基质中的loop；图b, 以带状图观察ANT，以蓝色表示N末端，以红色表示C末端。背景染色部分为膜内疏水部分；图c, 从内部角度观测ANT，两个心磷脂以黑色的球和短棒表示；图d, 从外部角度观测 (Pebay-Peyroula et al., 2003).Fig 1-3 Architecture of the ADP/ATP carrier. a, A schematic diagram of the carrier secondary structure. Transmembran

44、e helices, surface helices, intermembrane space loops and matrix loops are labelled H, h, C or M, respectively. b, A ribbon diagram viewing the carrier from the side. The structure is coloured according to the sequence blue (N terminus) to red (C terminus). Membrane boundaries are drawn in agreement

45、 with the hydrophobic segments of the helices. c, View from the inside. Two cardiolipins are represented in black as ball and sticks. d, View from the outside (Pebay-Peyroula et al., 2003).些原生动物的细胞膜上(Detke and Elsabrouty, 2008)。ANT 催化 ATP4-到 ADP3-的电位变化，产生巨大的负的膜电位，从而维持了通过内膜(大约-180 mv)的 ATP 和 ADP 的转换。

46、ANT 是巨大线粒体膜载体家族的一员，这个家族均由核基因编码。ANT家族成员都具有相似的结构特征，含有大约 100 个氨基酸残基的三重重复结构，6个包含 1822 个残基的跨膜结构域，C 末端和 N 末端都在膜间隙中，跨膜结构域之7水稻 VDAC 和 ANT 基因家族表达研究间通过亲水区域连接；3 个大约 40 个氨基酸的 loop 面向基质，两个较短的 loop 面向膜内空间，分别为 26 和 18 个氨基酸长度，如图 1-3(Pebay-Peyroula et al., 2003)。ANT 的另外一个重要特征是依赖每分子蛋白质紧密结合的 6 分子的心磷脂来实现其活性。在酿酒酵母中的研究表明

47、 ANT 的 C 末端区域在识别结合以及运输核苷酸中起了重要作用(Clemencon et al., 2008)。1.2.2 ANT 基因的表达已报道人的 ant 基因有 4 个 (Dolce et al., 2005)，大、小鼠的有 3 个(Rodic et al.,2005)，水稻的 ant 基因 1 个(Hashimoto et al., 1993)。人的 4 个 ANT 蛋白异构体之间有 60%到 80%的保守性，ANT1、ANT2 和 ANT4 是组织特异性表达的，而 ANT3是组成性表达的(Stepien et al., 1992; Dolce et al., 2005)。ANT1

48、 和 ANT3 的超表达会引起线粒体内膜膜电势的下降，导致细胞凋亡；但是，过表达的 ANT2 则没有这种效应(Bauer et al., 1999; Zamora et al., 2004)，有实验证明，ANT2 的表达是受细胞生长调控的(Luciakova et al., 2008)，ANT2 在增殖细胞中表达量很高，当抑制其表达时会引起细胞生长变慢(Jang et al., 2008)。在大鼠中 ANT 由 3 个不同的基因编码，其表达具有组织特异性，如在心脏中 ANT1 表达占优势(Dorner et al., 1999; Rodic et al., 2005)。在高等植物中，盐胁迫和低

49、温胁迫时水稻ANT基因的表达量增加(Hashimoto etal., 1993)。而在微生物盘基网柄菌(D. discoideum一种低等真核生物)中，其多细胞发育初期的几个小时内ANT基因的表达会迅速下降，但是在整个分化阶段蛋白质的水平维持不变(Bof et al., 1999)。1.2.3 ANT 在细胞内的定位与生理功能ANT 是定位于线粒体内膜上的核编码的蛋白，其主要作用是介导 ADP/ATP 在细胞质和线粒体基质之间的运输 (Dahout-Gonzalez et al., 2006; Bamber et al., 2007)。最初认为 ANT 的功能单位是同源二聚体(Postis e

50、t al., 2005)，近来在酵母中发现的ANT 的功能单位是单体(Bamber et al., 2007; Bamber et al., 2007)。ANT 是线粒体上最小的转运蛋白，其转运效率相对线粒体上别的膜通道缓慢，但被它转运的ADP/ATP 却几乎是能够跨膜运输的量最大的代谢产物(Knirsch et al., 1989; Bamberet al., 2007)。8中南民族大学硕士学位论文ANT 除了在能量代谢中的主要功能外，还认为在 MPT 和细胞凋亡诱导过程中起作用(Walther et al., 2007)。1.2.4 ANT 在 MPT 以及细胞死亡中的作用ANT在MPT和

51、细胞凋亡中的作用仍存在争议，一般认为，ANT作为MPT的重要组成成分，与VDAC一样，参与了细胞凋亡诱导的某些过程。ANT敲除的小鼠肝细胞线粒体对ANT的配基不再敏感，而MPT依然具有活性并能够被CsA抑制，但必须使用比对照更高的Ca2+浓度(三倍)，才能诱导ANT缺失的线粒体膨胀。表明ANT并不是MPT发生的必要条件，由此推论ANT可能在PTP参与的细胞死亡中并不重要(Kokoszka et al., 2004)。在HIV-1 Vpr诱导的细胞凋亡中，依赖Bax也并不依赖ANT(Andersen et al., 2006)，暗示ANT在细胞凋亡中也并不重要。但是，在酵母中的研究表明，虽然缺失

52、ANT的细胞对对H2O2诱导的细胞凋亡没有作用，但对乙酸和联氨诱导的细胞凋亡具有保护作用(Pereira et al., 2007)。另也有研究表明，ANT参与了肿瘤坏死因子诱导的细胞凋亡(Yang et al., 2007)。综上所述，由于细胞凋亡的复杂性，ANT在凋亡中的作用与VDAC一样，可能也具有组织特异性和不同凋亡诱导因子的依赖性。1.3 水稻 VDAC 和 ANT 基因的研究在水稻(Oryza sativa L.)中，已报道有 3 个 vdac 基因(Al Bitar et al., 2003) 和 1个 ant 基因(Hashimoto et al., 1993)。水稻的 3 个 vdac 基因具有不同的表达模式，其中 osVDAC2 是组成型表达的，而 osVDAC1 和 osVDAC3 则是差异表达的(Roosens et al., 2000; Al Bitar et al., 2003)；osVDAC1 和 osVDAC3 都在花中表达，但 osVDAC3的表达明显较 osVDAC1 强；水稻 VDAC 蛋白在细胞中的定位研究表明，除 1 个只定位于水稻细胞线粒体上外，有 2 个 VDAC 蛋白还定位在高尔基体上(Asakura1 et al.,2006)。本实验室采用 HMMER(Eddy, 1998)方法，对水稻(日本晴和