三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨 (1)

1、时珍国医国药 2008年第 19卷第 1期LISH IZHEN M EDIC INE AND MATERIA M ED ICA RESEARCH 2008VOL. 19 NO. 1三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨马陶陶, 张群林, 李俊* , 孟晓明, 黄 成, 陈玉璞( 安徽医科大学药学院, 安徽合肥 230032)摘要: 目的 探讨以芦丁作为对照品, 采用三氯化铝 ( A lC l ) 比色法测定中药总黄酮含量的专属性, 并建立 A lC l 比色法33测定中药总黄酮含量的最优条件。方法 通过对几类典型结构的黄酮类及多酚类化合物 A lC l3 显色前后的吸收峰 ( 200 600

2、nm ) 进行比较, 分析以芦丁为对照品的 A lC l3比色法测定中药总黄酮的合理性。结果 A lC l3显色后, 部分黄酮类物质在 421 nm 处有较强吸收。结论 采用 A lCl3比色法测定中药总黄酮的含量具有合理性, 并建立了 A Cl l3比色法测定中药总黄酮含量的最优条件。关键词: A lC l比色法;总黄酮; 芦丁3中图分类号: R248. 2文献标识码: A文章编号: 1008-0805( 2008) 01-0054-01A lC l3 Colorim etry for Determ ination of Total F lavonoidsM A T ao-tao,ZHANG

3、 Q un- lin,L I Jun* , M ENG X iao-m ing,HUANG Cheng, CHEN Y u-pu(C ollege of Pharm acology of AnhuiM ed ical University,H efei 230032, China )Abstract: Objective T o d iscuss the spec ia lity of A Cl l3 co lor mei try w ith rutin as reference substance fo r evalua tion on the contento f to tal flavo

4、no ids and investigatethe optimum cond ition o f A lC lco lo rim etry. M ethods T o m ake a ser ies of flavono ids and po ly-3pheno ls w ithtyp ica l structure w ith A lC l3 and m easure the ir absorption curves at the range of 200 600 nm. Results A t the w ave-length o f 421 nm,some flavono id- lik

5、e compounds show ed the sim ila r abso rption w ith rutin. Conclusion It is reasonab le to de ter-m ine the tota l flavono ids by using A lC l co lor mi etry w ith ru tin as re ference substance and establish the optimum cond ition of A lCl33co lo rim etry.K ey words: A lC3 co lor ime try;T ota l fl

6、avono ids; R utin黄酮类化合物 ( F lavono ids) 是以 C6 - C3 - C6结构为基本母磁仪器厂 )。核的色原烷或色原酮的衍生物, 以其广泛的药理作用倍受青睐,试剂: 芦丁, 葛根素, 2, 3 - 二羟基苯甲酸, 绿原酸, 和厚朴而中药材中总黄酮的含量测定成为近年来研究黄酮化合物所关酚, 阿魏酸, 儿茶素, 木犀草素, 异鼠李素, 山柰奈酚, 槲皮素, 金丝注的焦点。中药总黄酮的含量测定一般采用比色法、高效液相色桃苷,蒙花苷、橙皮苷均购自中国药品生物制品检定所。三氯化谱法等 1 。比色法是被5中国药典6所采用的最常见的总黄酮测铝, 醋酸钠, 冰醋酸, 甲醇均

7、为分析纯, 水为双蒸水。定方法, 其中又以 N aNO2 - A l( NO 3 ) 3 - N aOH 比色法常用 2 。这2方法种方法以 N aNO2 - A l( NO3 ) 3为显色剂, 在碱性条件下, 利用其与2. 1供试品的制备 以芦丁为例, 精密称取芦丁标准品 ( 120 e黄酮物质生成红色铝螯合物为特征, 以芦丁为对照, 在 510 nm 处烘干至恒重 ) 10. 0 m g, 甲醇定容至 50 m ,l 配成 0.2 mg /m l的芦丁测定吸光度, 从而得到待测物质总黄酮的含量。郭亚建等 3 曾母液。对这种方法的专属性进行了讨论, 发现具有邻二酚羟基的非黄酮2.2显色试剂的

8、配置 精密称取 A lC l 1.34g, 甲醇定容至3COON a# 3H2 O类物质在芦丁显色的最大波长处 ( 510 nm 左右 )也有较强吸收,100m ,l 配成 0. 1 mo l/L 的溶液。精密称取CH 3而黄酮类成分黄芩素、山柰酚在此波长处没有吸收, 从而说明采2.72 g, 双蒸水溶解至 100 m ,l 配成 0. 2 m o l/L 的溶液。精密量取用 N aNO- A l( NO)- N aOH 比色法, 以芦丁作为对照, 不能排1. 15 m l冰醋酸, 双蒸水稀释至 100 m l配成 0. 2 m o l/L 的醋酸溶233液 4, 5 。除非黄酮类物质的干扰,

9、 这种方法测定中药总黄酮含量的专属性不强。2. 3芦丁紫外吸收峰的扫描 精密量取 1 m l芦丁母液溶液, 置因此, 本实验采用另一种常用的比色法: A lC l 比色法, 对几于 10 m l容量瓶, 加入 2 m l 0. 1 m o l/L 的 A lC l3溶液, 甲醇定容, 充3分显色 20 m in 6 , 在 200 600 nm 范围扫描, 记录吸光度值。类典型结构的黄酮类化合物 ( 芦丁、儿茶素、木犀草素、鼠李素、山柰奈酚、槲皮素、葛根素、金丝桃苷、橙皮苷 )及多酚类化合物2.4供试品紫外吸收峰的扫描 精密量取 1 m l供试品 (芦丁, 葛( 2, 3 - 二羟基苯甲酸,

10、绿原酸, 和厚朴酚, 阿魏酸 ) A lC l显色前根素, 2, 3 - 二羟基苯甲酸、绿原酸、阿魏酸、和厚朴酚、儿茶素、木3犀草素、异鼠李素、山柰奈酚、槲皮素、金丝桃苷、蒙花苷、橙皮苷 ),后的吸收峰 ( 200 600 nm )进行比较, 分析以芦丁为对照品的A lC l比色法测定中药总黄酮的合理性, 并对芦丁显色的 pH 值,按/ 2.30 项下方法, 在 200 600 nm 扫描样品的紫外吸收峰。3标准曲线及可行性考察 从芦丁母液中精密移取 0. 0, 0. 2,A lC l3浓度、显色温度等条件进行优化研究。2.51 仪器与试药0.4, 0. 6, 0. 8, 1. 0 m l溶液

11、, 平行两份, 第 1 份直接加入 2 m l 0. 1A g ilent 8453紫外分光光度计; PH S - 3C 精密 pH 计 (上海雷m o l/L 的 A lC l显色 20 m in; 第 2 份加入 2 m l 0.1 m o l/L A lC l,331m l pH 为 5. 2 的 N aAC - HA C 缓冲溶液, 40e 水浴显色 10 m in,收稿日期: 2007-04-27;修订日期: 2007-07-12基金项目: 2006 年安徽省科技攻关计划 (N o. 06013134B);安徽省自然科学研究重点资助项目( No. 2006K J095A )作者简介:

12、 马陶陶 ( 1982-), 女 (汉族 ), 安徽宿州人, 现为安徽医科大学药学院研究生, 硕士学位, 主要从事天然药物的研究和开发工作.* 通讯作者简介: 李 俊 ( 1960-), 男 ( 汉族 ), 安徽无为人, 现为安徽医科大学药学院教授, 博士学位, 主要从事抗炎免疫药理学及天然药物的研究和开发工作.分别做标准曲线, 并以金丝桃苷为样品, 考察方法的可行性。3 结果3. 1 芦丁显色的紫外光谱图 在黄酮类化合物的紫外光谱图上,主要有苯甲酰基部分引起的吸收带 I ( 300 400 nm )和桂皮酰基部分引起的吸收带 II ( 240 280 nm ), 加人铝盐可使黄酮类化合物与铝

13、离子形成稳定的络合物, 带 I 红移, 吸光度明显增大。当加入 A Cl l3充分显色后, 芦丁吸收峰从 359 nm 红移至 421 nm, 且吸光度有所增加。见图 1。# 54#L ISH IZH EN M EDIC INE AND M ATER IA M ED ICA RESEARCH 2008 VOL. 19 NO. 1时珍国医国药 2008年第 19卷第 1期峰位置及吸光度大小的影响。如图 3 ( c)。结果表明, 水浴温度 40e 是芦丁显色的优化条件之一。 . 芦丁 . 芦丁 + A lC l3图 1 芦丁加入 A lC l3前后的紫外光谱图3. 2A lC l3比色法专属性探讨

14、 在 200 600 nm 对几种典型结构的黄酮类物质及多酚类物质 A lC l3显色前后的紫外吸收峰进行比较 , 结果发现显色后金丝桃苷、异鼠李素、山柰奈酚的吸收峰位置和芦丁的相似, 都在 421 nm 左右, 而其他物质的与芦丁的不同。如图 2 为显色后各物质的紫外光谱图。a-异鼠李素 b-山柰奈酚 c-金丝桃苷 d-芦丁 e-儿茶素-f和厚朴酚 g-阿魏酸 h-绿原酸 -i蒙花苷 -j葛根素 k-2, 3 - 二羟基苯甲酸 -l橙皮苷 m-木犀草素 n-橙皮苷图 2 14 种物质显色后的紫外光谱图3. 3 显色条件的优化3. 3. 1 pH 值的影响 采用 N aA c - HA c 缓

15、冲盐溶液调节溶液的 pH 值, 实验表明, 当缓冲盐的 pH 值小于 5. 2 时, 芦丁的吸收峰在 402 nm 左右, 且吸光度值较小; 当 pH 值在 5. 2 6. 0 时, 吸收峰在 421 nm 左右, 吸光度值增大, 如图 3( a)。且当 pH 值为 5. 2 时, 吸光度值最大, 因此选择 pH 为 5. 2的 N aA c - HA c缓冲盐体系作为优化的显色条件之一。3. 3. 2A lC l3的浓度 以 2 10- 5 g /m l的芦丁溶液, pH 值 5. 2的N aA c - HA c 缓冲盐为条件, 在 6. 6 10- 5 0. 33 mo l/L 范围内讨论

16、 A lC l3浓度对芦丁吸收峰的位置及吸光度大小的影响, 结果发现: 1B 600 n: n 1B 2 时, 即 A lC l浓度为 3. 3 10- 4芦丁A Cl l33 0. 1 m o l/L 时, 吸收峰在421 nm 左右, 且吸光度的值随 A lC l3浓度的增加而变大。如图 3( b)所示。 n芦丁 : nA lC l3 1: 2, 即 A lC l3 浓度小于 3. 3 10- 4 m o l/L 时, 吸收峰在 365 nm 左右, 且吸光度减小。 n芦丁: nA Cl l3 1: 600, 即 A lC l3浓度大于 0. 1 m o l/L, 吸收峰移至 404 nm

17、 左右, 且吸光度减小。因此选择 A Cl l3浓度为 0. 1 mo l/L 为芦丁显色的优化条件之一。3. 3. 3 显色温度对吸光度的影响 实验中由于显色时间较长, 为了提高效率, 采用水浴加热。加热 10 m in, 考察水浴温度对吸收a-pH 值对显色反应的影响b-A lC l3 浓度对显色反应的影响c-显色温度对吸光度的影响图 3 显色条件对芦丁吸光度的影响3. 4 显色稳定性考察 以 2 10- 5 g /m l 芦丁溶液, 0. 1 m o l/ LA lC l3, pH 值 5. 2N aA c - HA c 缓冲溶液为条件, 考察显色的稳定性, 结果表明, 显色 150 m

18、 in, 吸光度变化的 RSD 为 2. 862% , 说明以芦丁为对照, A lC l 比色法显色稳定。3. 5 线性及可行性3考察 以一定浓度的金丝桃苷作为样品, 直接加入 2 m l 0. 1 m ol/L 的 A lC l, 显色 20 m in, 其标准方程: Y =0. 007 79+ 27 351. 190 48X, RA3 = 0. 999 22, 测得的金丝桃苷的浓度是 2. 75 10- 4 g /m ,l 回收率为 121. 15% ; 而优化后的方法: 2m l 0. 1 m o l/L A lC l,1 m l pH 为 5. 2 的 N aA c - HA c 缓冲

19、溶液,340e 水浴显色 10 m in, 其线性方程为 Y = 0. 001 53 + 29 595. 209 32X, RB = 0. 999 72, 测得的金丝桃苷浓度为 2. 306 10- 4 g /m ,l 回收率为 101. 58% 。由此说明 0. 1 mo l/L A lC l3, pH5. 2 的 N aA c - HA c缓冲盐溶液, 40e 水浴显色 10 m in, 方法的准确度更高, 为 A lC l3比色法的优化方法。4讨论葛根素、蒙花苷、橙皮苷加入 A lC l3, 反应前后紫外吸收峰的位置没有发生改变, 而其余物质的紫外吸收峰均发生红移。从结构上分析, 葛根素

20、、蒙花苷、橙皮苷只存在 5 位羟基, 不存在邻二酚羟基和 3 位羟基, 由此可见 A lC l3的显色反应主要发生在 3 位羟基、4位羰基和邻二酚羟基, 只存在 5 位羟基、4 位羰基时黄酮类物质与 A Cl l3不发生反应。芦丁与 A lC l3发生显色反应, 生成黄色络合物, 在 421 nm 左右有较强吸收。实验对几种常见的多酚类化合物紫外光谱图进行了扫描, 结果表明对于含邻二酚羟基的非黄酮化合物: 2, 3 - 二羟基苯甲酸、阿魏酸、和厚朴酚、绿原酸, A lC l3显色前后在 421nm 左右均没有吸收峰, 消除了非黄酮类化合物对显色的干扰。槲皮素为芦丁的苷元, 显色后在 437 n

21、m 左右有较大吸收, 而芦丁的最大吸收峰在 421 nm, 说明黄酮的苷和苷元的极性相差较大, 槲皮素 3位羟基可能对反应有影响。木犀草素的结构和芦丁相比, 3位没有羟基, 显色后在 414 nm 有最大吸收, 从而进一步说明 3 位羟基可能对 A lC l3显色反应有影响。# 55#时珍国医国药 2008年第 19卷第 1期LISH IZHEN M EDIC INE AND MATERIA M ED ICA RESEARCH 2008VOL. 19 NO. 1具有典型结构的常见的黄酮类苷和苷元: 金丝桃苷, 芦丁, 异鼠李素, 山柰奈酚, A lC l3显色前在 421 nm 处无吸收, 显

22、色后均在芦丁的最大吸收峰 421 nm 左右有较大的吸收。在现今的实验条件下, 对于大多数黄酮类中药材而言, 多含有黄酮苷, 常见的苷在此波长处有较强吸收, 而非黄酮类物质在此处无吸收。因此以芦丁作为对照, A lC l3 比色法可以成为测定中药总黄酮含量的理想方法。对于任一络合反应, 溶液的酸碱度会影响金属离子的水解及存在形式, 影响络合物的组成。当采用盐酸 (氢氧化钠 )调节显色溶液 pH 值时, 因其酸 (碱 )性较强, 破坏络合物的结构, 无法测得中药总黄酮含量的真实值, 而采用 N aA c - HA c 缓冲盐溶液时 , 加入前后芦丁的吸收峰位置不变, 仍在 359 nm 处, 所

23、以采用 N aA c - HA c 缓冲盐调节显色溶液的 pH 值。从方法的可行性考察结果可以看出, 以金丝桃苷为样品, 采用 2 种方法考察回收率, 优化的方法准确度更高, 所以加入 0. 1m o l/L A Cl l3, pH 为 5. 2的 N aA c - HA c缓冲溶液, 40e 水浴加热 10 m in为 A Cl l3比色法的优化显色条件。参考文献: 1 郑 健, 陈焕文, 刘宏伟, 等. 紫外可见分光光度法在药物分析中的应用 J . 分析科学学报,2002, 18( 2): 158. 2 国家药典委员会. 中国药典, I 部 S . 北京: 化学工业出版社, 2005: 2

24、56. 3 郭亚健, 范 丽, 张珍兰, 等. 关于比色法测定总黄酮方法的探讨 J . 药物分析杂志, 2002, 22 ( 2): 97. 4 丁明玉, 赵纪萍, 李擎阳. 贯叶金丝桃提取物中总黄酮的测定方法 J . 分析实验室, 2001, 20 ( 6): 45. 5 张锡瑜. 分析化学原理, 第 2 版 M . 北京: 科学出版社, 2000: 398. 6 刘 斌, 石任兵, 王 伟. 蒲黄总黄酮含量测定方法的研究 J . 北京中医药大学学报, 2001, 24( 4 ): 23.五倍子醇提液对假单胞铜绿杆菌生物膜的影响黄晓敏, 简润好, 余晓铃, 曾穗红, 简笑欢, 黄伟雄, 吴中

25、兴(韶关学院英东生物工程学院, 广东韶关512005)摘要: 目的 研究五倍子醇提液对假单胞铜绿杆菌生物膜的影响。方法 采用试管对倍稀释法测定五倍子醇提液对假单胞铜绿杆菌的最小抑菌浓度 (M in mai l Inhibitory Concentration, M IC)。采用平板改良体外复制假单胞铜绿杆菌生物膜模型 , 并检测五倍子醇提液的不同 M IC 浓度对假单胞铜绿杆菌生物膜的影响作用。结果 五倍子醇提液对假单胞铜绿杆菌的 M IC 为 31. 25 mg /m l, 1. 5倍的 M IC( 46. 8 mg /m l)能使生物膜活菌数明显减少, 但不能完全清除生物膜上的细菌, 2

26、倍的 M IC( 62. 5 m g /m l)对细菌生物膜有完全清除作用。结论 五倍子对铜绿假单胞菌生物膜有清除效应, 但还需要进行临床用药研究。关键词: 五倍子醇提液;假单胞铜绿杆菌; 细菌生物膜中图分类号: R378. 1 + 1; R285. 5文献标识码: A文章编号: 1008-0805( 2008) 01-0056-03E ffects of the E thanol - Extract of G alla Chinensis on P sedom onas aerug inosa B iofilmHUANG X iao-m in, JIAN R un-hao, YU X iao

27、- ling,ZENG Su-ihong,JIAN X iao-huan, HUANG W ei-x iong,W U Zhong-x ing( Yingdong Colleg e of B ioeng ineering, Shaoguan University, Shaoguan,G uangdong 512005, China )Abstract: Objective T ostudy the effects o f ethano l -extract o fG. ch inensis onP. aerug inosa B io film . M ethods M in im al inh

28、 ib-itory concentration (M IC)was tested by doub le dilution, andP. aerug inosabiofilm w as induced in vitro by improv ed B rownp latem ethod. T he effec ts o f ethano l - extract o fG. Ch inensisin differentM ICon P. aerugino sa b io film w ere dete rm ined . Results T heM IC of e thano l - ex trac

29、t o fG . chinensis to P. aerugino sa w as 31. 25mg /m ,l1. 5M IC( 46. 8mg /m l)of G a lla Ch inensis decoctioncoulde obv iously reduce the am ount of bacter ia on P. aerug ino sa b io film,and 2M IC( 62. 5 m g /m l)had the elim ina ting e ffect onit. Conclusion G a lla Ch inensis has the e lim inating effect on P. aerug inosa B io