在线凝胶渗透色谱―气相色谱―串联质谱联用检测烟叶中的农药残留

1、在线凝胶渗透色谱气相色谱串联质谱联用检测烟叶中的农药残留1 引言 为了防治病虫害，烟草在育种、种植、调制和保存期间要使 用农药。残留农药会降低烟叶质量，加剧环境污染， 并威胁人 类和其它生物的健康 1 。因此，烟叶中的农药残留检测对保证 烟叶质量和环境安全具有重要意义。 由于烟叶样品基质复杂， 其 中残留农药含量低(低至 ng/g 级)，因此通常需要样品预处理 过程才能进行后续测定 2 。目前，液-液萃取3 、固相萃取 4 、 固相微萃取 5 等方法已用于烟叶中农药残留测定。这些方法存 在有机溶剂消耗量大、操作繁冗费时、回收率低等不足。 Anastassiades 等 6 开发了“快速、简便、

2、经济、高效、耐用 且安全(Quick , easy , cheap , effective , rugged and safe , QuEChEF) ”的样品前处理技术。 QuEChER方法具有回收率高、 稳定性强和被分析目标物范围广等优点， 因此在农药残留检测中 广泛应用。常规QuEChER方法在净化步骤中通过离心或过滤 将吸附剂与样品液分离，耗时费力。为了克服这一缺陷，本研究 组以石墨化炭黑/乙二胺-N-丙基键合硅烷/四氯化三铁(GCB/PSA/Fe3O4复合材料为吸附剂，改进了 QuEChER方法7 ，吸附剂可以在磁场作用下与提取液快速分离，具有操作简 单、快速高效的优点。在线凝胶渗透色

3、谱-气相色谱-质谱（GPC-GC-M）是将凝胶渗透色谱和气相色谱 -质谱在线联用的分析检测技术，不但具有 抗基质干扰能力强、灵敏度高的优点，而且可以连续自动分析， 能提高分析速度和结果的准确性，已被应用于农药残留检测8 10。本研究采用改进 QuEChER方法对烟叶样品前处理，以在线凝胶渗透色谱-气相色谱-串联质谱（GPC-GC-MS/M）检测，选取 烟草种植生产中对烟叶质量和烟草制品产品安全有影响的常用 10种除草剂、抑芽剂和杀虫剂为代表性化合物，建立了烟叶中 农药残留量的快速、准确、灵敏分析方法。2 实验部分2.1 仪器与试剂在线GPC-GC-MS/M系统（日本岛津公司）,GPC配有LC-

4、20AD 泵，SIL-20A自动进样器，CTO-20AC柱温箱，DGU-20A3R兑气机 和SPD-20A紫外检测器；GC-MS/MS包括日本岛津2010-plus气 相色谱和TQ8030三重四级杆质谱，由FCV-12AH电磁阀实现GPC 和GC-MS/MS勺在线连接。用Quanta 200扫描电镜（Quanta 200, FEI， Holland ）对材料形貌进行表征。环己烷和丙酮（色谱纯，韩国德山纯化工XX公司）。所用水由Milli-Q 系统（Milford , MA, USA）制得。10种目标物 和内标（磷酸三苯酯）均购自德国 Dr. Ehrenstorfer 公司，以 甲苯（必要时添加

5、丙酮或甲醇）为溶剂配制目标物母液（ 100 卩g/mL）。混合标准工作溶液（内标浓度为20 ng/mL ）以甲苯配制，并在-20C下避光保存。采用溶剂热方法制备Fe3O47:在200 mL反应釜内将5.0 g FeCI3?6H2O 溶解在100 mL乙二醇 中并搅拌得到澄清溶液，再加入15.0 g NaAc和50 mL乙二胺，搅拌30 min，将反应釜于200C下反应8 h。待反应釜降温后， 用水和乙醇清洗产物，60 C下干燥，备用。制备磁性吸附剂时，将0.4 g GCB、0.5 g PSA 和1 g Fe3O4置于15 mL具盖玻璃瓶 内，用5 mL乙腈清洗3次后，将产物在60C下干燥即可。

6、2.2 仪器条件GPC条件：色谱柱为 Shodex CLNpakEV-200 (150 mmx 2 mm 16卩m ;柱温为40C;流动相为环己烷-丙酮(70 : 30, V/V ); 流速0.1 mL/min ;进样量10卩L; GPC攵集时间为3.305.30 min; GC-MS/MS件：惰性前置柱 5 m X 0.53 mm 空柱；预柱 DB-35 ms (5 m X 0.25 mm X 0.25 卩 m)，分离柱 DB-35 ms (25 mX 0.25 mmX 0.25卩n)，柱温箱程序：初始温度 82C, 保持5.0 min，再以8C/min升至300C，保持7.75 min ;

7、不分 流进样，进样时间7.0 min；高纯He为载气，压力程序：由120 kPa 开始，以 100 kPa/min 升至 180 kPa，保持 4.4 min，再以 49.8 kPa/min 恢复至原始压力，保持 33.8 min ;程序升温进样 口程序：120C保持 5 min,以 100C/min 升至 250C，保持 33.7 min;接口和离子源温度为 300C和200C ；电离源为EI源；电 离电压70 eV；溶剂延迟时间15 min；目标物及内标的多反应监 测(MRM参数如表1所示，碰撞气为 Ar，压力200 kPa。2.3 样品制备 本研究建立烟叶提取液快速净化和检测的方法， 因

8、此直接采 用文献 2报道的方法提取烟叶：称取2.00 g烟叶于离心管中，加入 10 mL 水浸润样品；静置 10 min 后加入 10 mL 乙腈 和100卩L内标溶液，振荡2 min ；于-20C下保持10 min后加 入5 mL甲苯、4 g无水Na2SO4 1 g NaCI ，1 g柠檬酸钠和0.5 g 柠檬酸氢二钠，振荡 2 min 后离心 5 min ，收集上层提取 液；提取液的净化和检测方法为：取 0.5 mL 提取液到装有磁性 吸附剂的离心管中，振荡 1 min ；在磁场下将磁性吸附剂与溶液 分离，所得溶液为待测液，可进行在线GPC-GC-MS/M分析。将不含目标物的净化液浓缩吹干

9、， 再加入相同体积、 不同浓度的系 列标准工作溶液， 混匀溶解即得到基质匹配标准曲线。3结果与讨论3.1 磁性吸附剂的表征如图1a所示，PSA表面光滑，而磁性吸附剂中 PSA表面粗 糙（图1b）,且在PSA颗粒之间也有材料均匀分布，观察是 GCB 和Fe3O4颗粒（图1c）。Fe3O4能使吸附剂在磁场作用下与样品 溶液快速分离，同时PSA和GCB能分离提取液中的杂质。3.2 GPC收集时间考察图2为在线GPC-GC-MS/M系统的示意图。其原理为：样品 经GPC柱分离，废液直接排出系统，含有目标物的馏分先被储存 在定量环（0.2 mL ）中，再全部注入 GC注入GC的样品通过打开溶剂蒸气出口实

10、现溶剂的排出， 同时目标分析物在保留在预柱 中。待溶剂排出口关闭后柱，温箱开始升温，目标物进入分析柱 分离。因此选择收集时间显得尤为重要。 目标物的分子量在溴氰 菊酯和灭螨蜢之间，因此目标物在GPCh的保留时间也介于二者 之间，二者在 GPC上的保留时间为3.50和5.08 min。考虑灵敏 度和基质去除效果，确定收集时间为3.305.30 min。3.3改进QuEChER方法的优化为了得到较好的净化效果， 优化了磁性吸附剂的用量和净化 时间（GCB PSA和Fe3O4之间的质量比为 4 ： 5 : 10）。如图3a 所示，随着吸附剂用量增加， 提取液的颜色由黄色逐渐变为近无 色，当吸附剂用量

11、达到80 mg时，继续增加用量对净化效果改善 不大。且在考察的范围内，各目标物的峰面积没有变化，这可能 是因为在烟叶提取液中含有甲苯， 使吸附剂与含苯环目标物之间 的相互作用力减弱而引起的。 考虑净化效果和吸附剂用量， 将吸 附剂的用量定为80 mg。在0.56.0 min范围内，净化时间对 净化效果影响不大， 且目标物的峰面积没有变化，这是因为吸附剂在净化时是分散的， 可以使吸附快速达到平衡，因此净化时间对净化效果没有太大影响。为了稳定净化效果，净化时间选取1.0 min 。比较了本方法与常规 QuEChER方法的净化效果，如图3b所 示，未经净化的烟叶提取液颜色为黄色，经过常规 QuECh

12、ER方 法净化后，提取液颜色变浅；经过本方法净化后，提取液几乎无色（山）。因此，本方法对色素等杂质的去除效果较好。3.4 方法确认 在优化条件下，考察了方法的检出限、定量限、线性范围和 重现性。检出限和定量限为目标物信噪比为 3和 10时对应的浓 度。以目标物浓度及其与内标峰面积之比为横、纵坐标，绘制工 作曲线。如表2所示，10种目标物的检出限在 0.94100 ng/L 之间，定量限在3.134 ng/L之间，线性相关系数 R20.9989。 本方法提取烟叶的结果与标准方法 11 相同，其中 9种目标物 （甲氰菊酯除外）的检出限为 40600 ng/L 。本方法能显著提 高灵敏度，是由吸附剂

13、降低基质干扰和在线GPC-GC-MS/M提高进样量引起的。为了考察本方法的重现性， 配制 3种浓度（各目标物线性范 围最低值的 2、10和 100倍）的样品，以一天内配制的 4个样品 和连续 3 天配制的样品进行分析，计算日内和日间相对标准偏 差。如表 3 所示，目标物的日内及日间精密度分别小于15.1%和19.8%，其中目标物在中浓度和高浓度下的日内及日间精密度数 值不高于 8.5%，低浓度下的日内及日间精密度数值相对较高， 这可能是由于测定误差引起的。美国分析化学家学会（Association of Official Analytical Chemists, AOAQ 提出 12 ，可接受

14、的精密度数值随着分析物的浓度或含量降低而升 高。本研究中目标物在低浓度（1.524.00卩g/L ）下的精密度 数值低于21% （目标物浓度为10卩g/L时所能接受的精密度数 值），说明本方法的重现性可以接受。3.5 实际样品分析为了证明本方法在实际样品中应用的效果， 采用本方法和现 行标准方法 11 处理 3 种烟叶样品并进行测定。 在样品 A 中测到 了七氟菊酯、 二甲戊灵和联苯菊酯， 采用本方法和标准方法均无 法对其进行定量分析； 在样品 B 中测到了七氟菊酯， 两种方法的 测定结果为1.06和1.03卩g/L ,对氟节胺和联苯菊酯均无法进 行定量分析；在样品C中测到了仲丁灵、二甲戊灵和

15、氟节胺，两 种方法的测定结果为 92.1和92.7卩g/L、108.2和112.2卩g/L 以及3.68和3.70卩g/L ,对七氟菊酯也均无法进行定量分析。 结果表明，本方法与标准方法11的检测结果相吻合。样品C中 测到的目标物数目最多，给出了其中被测到目标物的典型色谱 图。如图 4 所示，目标物均不存在干扰。同时，对净化前的烟叶 提取液直接进行在线GPC-GC-MS/M分析，检测结果与以上两种 方法不存在显著性差异：在样品B中测到了七氟菊酯，其浓度为 1.01卩g/L ；在样品C中测到了仲丁灵、二甲戊灵和氟节胺，其 浓度为 92.8 , 110.2 和 3.81 卩 g/L。将上述 3 种

16、样品加标后用本方法测定， 将所测量与实际加标 量相比得到相对回收率。如表 4 所示，目标物的相对回收率在 68.8%132.2%之间，不同实际样品中目标物在不同浓度下的回 收率相差较大，可能是因为不同产地烟叶样品的基质差异引起 的。使用气相色谱 -串联质谱检测烟叶中的农药残留时，基质增强效应和基质抑制效应同时都存在 13 ，其中含有氨基的极性农 药化合物在气相色谱分析时主要表现为基质增强效应 （如二甲戊 灵和联苯菊酯，回收率最高为 132.2%），但含有同一功能基团 的化合物由于理化特性的差异所呈现的基质效应也会有较大差 别（如七氟菊酯，回收率最低为68.8%），而且同一化合物在不同浓度水平和

17、样品基质下产生的基质效应程度也不尽相同 （如甲 氰菊酯） 14 。4 结 论采用磁性吸附剂净化烟叶提取液，再用在线 GPC-GC-MS/MS 检测，优化了在线 GPC-GC-MS/M条件和影响净化效果的因素， 在最佳的条件下建立了烟叶样品中 10 种农药残留量的测定新方 法，并用于实际烟叶样品的测定。 由于磁性吸附剂可以在磁场作 用下实现快速回收，且在线GPC-GC-MS/M系统可以提高进样量。 与现有标准方法 11 相比，本方法具有样品前处理过程操作简 单、净化能力强、灵敏度高等优点，为日常烟叶样品中农药残留 量的测定提供了一种可选择的方法。References1 Damalas C A，

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