定量PCR中-ct值的含义

1、实时荧光定量 PCF技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了 PCF从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决 PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得 到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。一.实时荧光定量PCRM理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCF反应体系中加入荧光基团， 利用荧光信号积累实时监测整个 PCF程，最后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法。1. Ct值的定义在荧光定量PCF技术中，有一个很重要的概念一一Ct值。C代表Cycle , t代表threshold , Ct值的

2、含义是：每个反应管内的荧光信号到达设 定的域值时所经历的循环数(如图1所示)。图1. Ct值的确定2.荧光域值(threshold )的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 SDcycle研究表明，每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线 性关系 1，起始拷贝数越多， Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可 作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代 Ct 值（如图 2 所示）。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样 品的起始拷

3、贝数。图 2. 荧光定量标准曲线4. 荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料现将其原理简述如下：1）TaqMa n荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一 寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCRT增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从 而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如图 3所示。图 3. TaqMan 荧光探针工作原理

4、2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量 SYBR荧光染料，SYBF荧光染料特异性地掺入 DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBF染料分子不会发射任何荧 光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR产物的增加完全同步。二内标在传统定量中的意义1 .几种传统定量PCR方法简介3:1 ）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物， 内标用基因工程方法合成。 上游引物用荧光标记， 下游引物不标记。 在模板扩增的同时， 内标也被扩增。 在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或 高效液相分离开来， 分别测定其荧光强度， 以内标为对照定量待检测模板

5、42）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标 记）。扩增后用内切酶消化 PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段， 而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧 光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数5。3) PCR- ELISA法: 利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合， 再加入抗地高辛或生物素酶标抗体辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物 显色。常规的PCR- ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线， 也可实现定量检测目的

6、 6。2内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测，即PCF到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异（见图4），因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所 造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略 定量的方法。图4.相同模板在同一台PCF仪上进行96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定； Ct 值则极具重现性三.内标对荧光定量 PCR的影响1. 实时荧光定量PCR无需内标实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的

7、局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品 Ct 值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定 量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：1）Ct 值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期）， 此时微小误差尚未放大，因此 Ct 值的重现性极好，即同一模板不同时间扩 增或同一时间不同管内扩增，得到的 Ct 值是恒定的。（见图 4）2）Ct 值与起始模板的线性关系由于 Ct 值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进 行定量测定，因此，实时荧光定量PCF是一种采用外标准曲线定量的方法。2. 内标

8、对实时荧光定量 PCM 影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的 起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著7,8 。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也 正是这个原因， 传统定量方法虽然加入内标， 但仍然只是一种半定量的方法。美国 Texas 大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法 学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外 标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方9。Applied Biosystems 公司的

9、7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧光定量PCR的金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采 用外标准曲线的方法，而不用内标进行定量。综上所述，利用外标准曲线的实时荧光定量 PCF是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转 基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域10,11,12,13 。参考文献1. Higuchi R, Fockler C, etal. Kinetic PCR analysis:real-time monitoring of DNAamplification reactions. Biotechnology,

10、1993, 11(9): 1026-1030.2. DNA/RNA Real-Time Quantitative PCR-Rev. BAppliedBiosystems3. 定量聚合酶链反应的研究进展与临床应用 . 中华检验医学杂志 2000, 23(2): 120-121.4. Anderson KM, Cheung PH, Kell MD. Rapid generation of homologous internal standards and evaluation of data for quantitaion of messenger RNA by competitive polym

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15、merase chainreaction to quantitate induced expression of interleukin-1 beta mRNA inischemic brain tolera nee. 2000, 59(2): 238-46.荧光定量PCR中基线、阈值、Ct值、扩增曲线、熔解曲线等基本概念基线(Baseline ):是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线 即是基线。荧光域值(threshold )的设定：一般将 PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR第 315个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在 PCR扩增的指数期。CT值：表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。扩增曲线1、曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明