心脏缺血再灌注损伤研究论文

1、心脏缺血再灌注损伤研究论文【关 键 词】 再 灌 注 损 伤Cha ngesofnitricoxidesyn thesisi ncardiacischemiareperfusi onin jury【AbstractAIM:Toi nv estigatetheexpressi onandfun ctio nofen dothelial nitri coxides yn thase(eNOS)a ndin ducibleNOS(iNOS)duri ngischemiarepe rfusio ninjury(IRI)i nrathearts.METHODS:IRIwasi nducedbyclamp

2、i n gthelefta nteriordesce ndi ng(LAD)ofcoro naryarteryfor1h,follo wedbyreperfusio n.Nitricoxides yn thase(NOS)activitiesofhearts wasassayedatvarioustimepo in tsa ndNOSprote ini evelsaswellasNOS mRNAexpressi on weredetermi nedbyWesternblota ndRTPCRmethodsres pectively.RESULTS:eNOSactivity,protei nle

3、vela ndmRNAexpressio n alli ncreasedafter26hofIRIa nddecreasedafter3doflRla ndthe ngr aduallyretur nedtobasallevelafter21d.iNOSwasexpressedafter12 hofIRIa ndreachedthepeaklevelatday3afterlRla ndthe ndecreasedt obasallevel.CONCLUSION:Theexpressio nofiNOSishighwhilethatof eNOSislowduri ngcardiacischem

4、iareperfusio ni njury.Properregul atio no feNOSa ndiNOSexpressi onm aybetherapeuticallyhelpfuli ntr eati ngpatie ntswithcardiacischemiareperfusi on injury.【Keywords reperfusi on injury; nitricoxides yn thase;heart【摘要目的：研究大鼠心脏缺血再灌注损伤(IRI)过程中一氧化氮合酶(NOS)的变化规律及其作用.方法：制作SD大鼠心脏IRI动物模型， 用同位素法测定正常及IRI心组织的NO

5、S舌性；用Western印迹和逆 转录PCR法分析eNOS和iNOS在IRI过程中蛋白和基因表达的变化. 结果：心脏eNOS舌性、蛋白和 mRNA表达水平，在缺血再灌注 26h 后均增高，3天后降低，21天后逐渐恢复到正常水平.心脏iNOS活性、 蛋白和mRN表达水平，在缺血再灌注12h后开始表达，3天达高峰， 然后逐渐降至正常水平.结论：单纯缺血并不引起 NOS活性的明显变 化,再灌注损伤使NOS勺mRN表达增加,酶的合成增多，活性增高.【关 键词】再灌注损伤；一氧化氮合酶；心脏 0引言一氧化氮(NO)和一氧 化氮合酶(NOS)在心肌缺血再灌注中起着极其重要的作用1. 一氧 化氮合酶(nit

6、ricoxidesynthesis,NOS)可分为原生型(eNOS)和诱生型(iNOS).cNOS依存在的部位分为神经型(nNOS)和内皮型(eNOS).心 脏组织内的NOS同功酶有两种，即eNOSW iNOS.参与炎性反应及急性 排斥反应等病理过程2.我们研究eNOSW iNOS在心脏IRI中的变 化规律及其作用，为其防治提供理论基础.1材料和方法1.1材料SD 大鼠购自华中科技大学同济医学院实验动物中心；iNOSAssayKit购自南京建成生物技术研究所；一抗羊抗大鼠iNOS或eNOSmA购自武汉博士德公司；HRP标记的兔抗羊IgG二抗购自Sigma公司；Trizol 裂解液、Oligo(

7、dT)、TaqDNA聚合酶和逆转录酶(AMVRT均为美国 Gibco公司产品；eNOS和 iNOS引物及内参照由上海博亚生物技术公 司合成.冠状动脉阻断再灌注模型制备3后在不同的再灌注时间点 处死大鼠，收集心脏标本，液氮急冻，-70C保存备用.1.2方法取雄性200220gSD大鼠120只，随机分为缺血再灌注(IRI )组和假手术(对 照,Control )组，每组60只，在再灌注不同时间点(0,0.5,1,2,6,12h 和1,3,7,14,21,30d )处死大鼠，每组每个时间点各 5只.1.2.1N0S 活性的测定IRI组大鼠取左室缺血区心肌0.2g,对照组大鼠取左室相 应区心肌0.2g

8、,采用iNOSAssayKit进行测定.心组织NOS舌性的测定 采用3 : H 精氨酸同位素法4 ，心组织在4C含有 1mmol/Lleupepti n,2mmol/Laproto nin ,1mmol/Lphe nylemthylsulfo n ylfluoride,1mmol/LDTT,1ml/LTritonX100的 30mmol/LHEPE缓冲液中匀浆，反应液为 30mmol/LHEPES缓冲液(pH7.4),含 1mmol/LCaCl2,100mmol/LNADPH,300mmol/Ltetrahydrobiopteri n,1m mol/Ldithiothreitol, 以 40m

9、mol/LL3H 精氨酸(37kBq/ 反应液)为反 应底物，在37C下反应30min,用200卩L含100mmol/LEGTA勺终止液 终止反应，反应体系过5cm的Dowex离子交换层析柱，加闪烁液后读取 放射性记数.蛋白定量用Bradford法,NOS活性用每克蛋白秒fmol (即 fkat/g )表示.1.2.2Western 印记检测iNOS和eNOS蛋白表达IRI组 大鼠取左室缺血区心肌0.2g,对照组大鼠取左室相应区心肌 0.2g,以 5 : 1(V/m) 比例 置 匀 浆 缓 冲 液 (含 50mmol/LTrispH7.5,150mmol/LNaCl,5g/L a cholat

10、esodium,1g/LSDS ,2mmol/LEDTA,10g/LTrito nX100,100mL/L甘 油 ,1mmol/LPMSF,2mg/Laprotinin )匀浆破碎组织.匀浆液于 4C 10000g 离心15mi n,收集上清液并用dyeb in di ng(BioRad)方法以牛血清清蛋白为标准测定蛋白浓度.取含30mg总蛋白的各组标本匀浆上清液点 样进行75g/LSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离Mr135000的iNOS及150000的eNOS蛋白.Mr标准采用预染的彩虹重组蛋白 (Amershaml nternatio nalplc,Bucki nghamshire,E ng

11、la nd).电泳后的凝胶通过 Western印记装置(BioRad)电转移蛋白质至hybondC膜 (AmershamPharmaciaBiotech,Buck in ghamshire,E ngla nd).转移膜经封闭、与1 : 500稀释的iNOS或eNOSmA何孵育过夜、洗涤、与 1 : 5000稀释的HRP标记的兔抗羊IgG室温孵育1h和第2次洗涤， 最后用 ECLWestern 印记荧光检测系统 (AmershamLifeSciences,ArlingtonHeights,IL)显色、曝光于 X 光底片(Fuji,Tokyo,Japan) 和显影、定影.将感光X光片上蛋白条带应用

12、 HPIAS200C型图像分析系统(同济千屏影像工程公司生产)扫描测定光 密度(OD)定量.1.2.3RTPCR检测iNOS和eNOS的转录IRI组大鼠取左 室缺血区心肌0.2g,对照组大鼠取左室相应区心肌 0.2g,采用Trizol 试剂提取总RNA以thermoscriptTMRTPCR系统进行逆转录和PCF反 应.PCR反应采取等量逆转录cDNA模板，分别以iNOS,eNOS,B actin 特异性引物进行PCR反应.扩增iNOS的引物对为：se nse :5 5 TGGCTTGCCCTTGGAAGTTTCTC3ense:5 TCCAGGCCATCTTGGT GGCAAGA3预计扩增产物

13、为574bpiNOScDNAt段，PCR反应条件为 95C5min; 95C30s, 60C45s, 72C 1min,共 30 个循环；72C 10min.扩 增 eNOS 的 引 物 对 为 ：sense:5 TACGGAGCAGCAAATCCACtfeense:5 CAGGCTGCAGTCCTTTGATC3，预计扩增产物812bp,PCR反应条件为95C5min;95C45s, 60C 45s, 72 C 1.25min，共 30 个循环；72 C 10mi n.内对照 p act in 的 扩 增 引物 对 为：sense:5 GTGGGGCGCCCCAGGCACCSense:5 CT

14、CCTTAATGTCA CGCACGATTTC3预计产物为 540bp, PCR反应条件为95C 2min;95C30s, 60C45s, 72C 1min,共 30 个循环；72C 10min.PCR产物以含0.5mg/L溴乙锭的10g/L琼脂糖凝胶电泳分离，紫外光照下观察 电泳条带,用BioRad凝胶分析系统分析结果，结果以光密度值（0D 表示.统计学处理：数据均以xs表示.应用SPSS11.0软件进行方差 分析,P0.05为有显著性差异.2结果2.1心脏IRI时NOS舌性的变化 单纯缺血1h,心脏NOS舌性与对照组相比无明显变化.心脏恢复血供 再灌注0.5h后cNOS活性即开始升高，以2

15、6h最高，与对照组相比， 差异有显著性意义（P0.01）;但12h后却迅速下降，3d时活性最低与 对照组相比，差异有显著性意义（P0.01）,以后逐日恢复,21d时心恢复 正常.iNOS活性在12对照组心脏表达微弱，再灌注2h后逐渐升 高,12h3d活性达高峰，与对照组相比差异有显著性意义（P0.01）,以 后逐渐下降,7d后基本恢复正常（Tab1）.表1心脏IRI后cNOS和iNOS 的活性变化（略）2.2Western印迹IRI组再灌注0.5h后心脏eNOS 蛋白质表达即开始升高,2h达到高峰,12h后开始减少,3d时为最低， 以后逐渐恢复,21d时恢复至对照组水平，与NOS活性变化相一致

16、.对 照组心脏检测出iNOS蛋白微量表达，但表达量远低于eNOS,IRI可诱 导其表达,在12h后表达逐渐增强，3d时表达最强，随后逐渐减弱，21d 时恢复对照组水平，也与iNOS的活性变化相一致(Fig1,Tab2).表 2Western印迹法测定心脏IRI后eNOS和iNOS蛋白表达 (略)2.3NOSmRNA勺基因表达IRI组心脏再灌注早期(0.512h)即可 诱导eNOSmRN表达增强,2h达高峰，此后随着损伤程度加重，其表达 迅速下降.3d低于对照组，以后逐步恢复,21d已相当对照组水平.在 对照组心脏iNOSmRNA表达微弱，再灌注12h后开始增强,3d达高 峰,21d恢复正常水平

17、(Fig2,Tab3).以上eNOS和iNOSmRN的消长变 化与蛋白质的表达和酶活力的变化一致.表3大鼠心脏IRI后eNOSffi iNOSmRN半定量结果(略)3讨论eNOS来源的NO具有舒张心血管，抑 制白细胞浸润和血小板的凝聚作用 5,从而对心脏可能起到保护作 用.Song等6的研究表明，在早期eNOS的过量表达对小鼠骨骼肌 的IRI具有保护作用，随着损伤过程的进展，心脏结构和功能的损害 不断加重,eNOS表达也相应迅速下降.这可能由于大量心肌细胞坏死 和凋亡,导致eNOS勺合成减少有关.eNOS的表达随着心脏损伤修复和 心功能的恢复逐步恢复.NO在心肌再灌注损伤中加重心肌损害.缺血

18、再灌注情况下，多种细胞因子上调巨噬细胞等内的iNOS的mRN表达， 立即产生大量的iNOS和NO过量的NO与氧迅速反应生成大量的氧自 由基如过氧亚硝酸阴离子(ONOO),后者可进一步反应生成 HO-,NO2,NO3等,其结果是引起和加重心肌缺血再灌注损伤7.我 们发现，单纯缺血1h对心脏NOS活性无明显影响，再灌注30min后 NOS活性即开始升高,26h到达高峰，持续到6h,此后迅速下降,24h降低到正常以下，21d时恢复至正常水平只TPCR分析发现eNOS及 iNOSmRN的变化与其蛋白变化相一致.可见在IRI中，早期eNOS勺高 表达可能参与了早期心血流的调节，对抑制心血管痉挛、减少炎性

19、细 胞的浸润有关；iNOS参与介导了心脏IRI的炎症损伤.可以设想，在 器官保存过程中或移植后早期使用iNOS的抑制剂，将会减少急性心肌坏死和凋亡以及急性排斥反应的发生，对IRI起到保护作用，促进 心功能的恢复，为临床提供科学的理论依据【参考文献】1张荣 庆，徐凯，程何祥，等.卡维地洛对缺氧心肌细胞NC生成的影响J . 第四军医大学学报，2002 ;23( 22 ):2071-2073.Zha ngRQ,XuK,Che ngHX,etal.Effectsofcarvedilolo nnit ricoxideproducti on bymyocardialcellsduri ngano xia:

20、J .JFourthMilMedUniv,2002 ; 23 (22): 2071-2073. :2许春梅， 董卫国，余保平，等低氧诱导因子1a及诱导型一氧化氮合酶在炎 症性肠病中的表达J .第四军医大学学报，2004; 25 ( 17):1558-1561.XuCM,Do ngWG, YuBP,etal.Expressio no fhypoxiai nducibl efactor1alpha(HIF1a )andinduciblenitricoxidesynthase(iNOS)genesininflammatoryboweldiseaseJ .JFourthMilMedUniv,2004 ;25(17):1558-1561.:3SuzukiM,SasakiN,MikiT,eta l.R oleofsarcolemmalK(ATP)cha nn elsi n cardioprotectio nagai nstischemia/reperfusio ninjuryi nm ice:J C