对小鼠黑色素瘤细胞肺转移的抑制作用mGM

1、文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编借，有帮助欢迎下载支持. 1文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑. 对小鼠黑色素瘤细胞肺转移的抑制作用mGM nn 作者：田蓉，程绍辉，于继云，李巍，刘玉峰 【关键词】黑色素瘤 Inhibition of lung metastasis of B16 melanoma cells transfectedwithmurinegranulocytemacrophage colonystimulating factor in mice Abstract AIM: To investigate the inhibition of lung m

2、etastasis of melanoma by a tumor vaccine of B16 melanoma cells transfectedwithmurinegranulocytemacrophage colonystimulating factor (mGMCSF) METHODS: The murine melanoma cell line B16 was transfected with the recombinant plasmid containing mGMCSF A cell line stably expressing mGMCSF was obtained by G

3、418 selection. The Balb/c mice were administered i.v. with B16 cells transfected with or without mGMCSF respectively and the lung metastasis was examined 2 weeks later RESULTS: The recombinant cell line B16TR was established after mGMCSF tranfection and the expression of mGMCSF was confirmed by RTPC

4、R The number of lung metastatic lesions of mice treated with B16TR was signif icantly fewer than that of mice treated with B16 (n二5, 125. 834. 3 vs 27. 824. 0, P0. 01). CONCLUSION: The mGMCSF transfection can significantly suppress the lung metastasis of melanoma in mice. The GMCSF can be a promisin

5、g adjuvant in the immunotherapy of melanoma. 【Keywords melanoma; mice; granulocytemacrophage colonystimulating factor; lung neoplasms/secondary; cancer vaccines 【摘要】目的：探讨小鼠粒细胞巨噬细胞一集落刺激因子 (mGMCSF)基因转导对B16黑色素瘤细胞肺转移的抑制效果.方法： 应用脂质体将含有mGMCSF基因的真核表达载体转染B16小鼠黑色素瘤 细胞，经G418加压筛选后，挑选表达mGMCSF基因的B16黑色素瘤细 胞.观察转导或

6、未转导mGMCSF基因的B16黑色素瘤细胞在Balb/c小 鼠体内的肺转移.结果：转导mGMCSF基因的B16黑色素瘤细胞可以 稳定表达mGMCSF,在小鼠模型上其肺转移灶数目显著少于未转染基因 的黑色素瘤细胞对照组，二者差异显著(n=5, 125.834.3 vs 27.8 24.0, P0.01).结论：mGMCSF转导可显著抑制小鼠黑色素瘤 细胞B16的肺转移，提示GMCSF具有治疗黑色素瘤的临床应用前景. 【关键词】黑色素瘤；小鼠；粒细胞巨噬细胞一集落刺激因 子；肺肿瘤/继发性；癌症疫苗 0引言 黑色素瘤是一种恶性程度很高的恶性肿瘤，早期即可发生肺、 脑转移其发病率有逐渐增高的趋势，然

7、而目前尚无有效的治疗方法 1-3.近年来，免疫治疗己经成为黑色素瘤治疗研究的一个热点 2, 4-5,其中，联合细胞因子的肿瘤细胞免疫是一个重要的方向， 可以涉及几乎全部与免疫系统相关的细胞因子.GMCSF具有可增强粒 细胞、巨噬细胞活性，增强MHC I , MHC II, B7分子的表达，增强抗原 提呈功能等广泛的生物学活性，因而可能在肿瘤的免疫治疗中具有着 重要作用.我们拟将GMCSF基因转染黑色素瘤细胞系B16,观察其对 黑色素瘤细胞生长及转移的影响，为抗黑素瘤免疫治疗进行有益的尝 试. 1材料和方法 1. 1材料B16小鼠恶性黑色素瘤细胞系、含有鼠GMCSF基因 的真核表达质粒pGEMT

8、easymGMCSF和E. coli JM109为本室保存.质粒 提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司；RNA提取试剂盒、RNA 逆转录试剂盒均为美国Promega公司产品；限制性内切酶、AMV逆转 录酶、随机引物均为宝生物公司产品；透析胎牛血清、DMEM培养基、 G418,脂质体转染试剂盒均为Gibco公司产品；68周龄雄性Balb/c 小鼠购自军事医学科学院实验动物中心. 1. 2方法根据mGMCSF序列及pcDNA3. 1多克隆酶切位点设计 引物，上游：5 GCTAGCACCATGTAACTGCAGAATTTAC3 ，下游 5 CTCGAGCTCATT TTTGGACTGGTTTTT3

9、z .引物由上海博亚生物工程有限公司合成. 以pGEMTeasymGMCSF质粒为模板，上述mGMCSF基因特异引物按常规方 法进行PCR扩增.将PCR反应产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析. 通过Nucleotrap kit (Clontech)回收阳性PCR产物.将回收的mGMCSF 基因及pcDXA3. 1分别用以Xhel和EcoRI双酶切，并用T4 DXA连接酶 连接后，转化E. coli JM109,获得重组质粒pcDNA3. 1/mGMCSF.将限 制内切酶进行酶切鉴定正确的菌种送上海生工生物技术公司测定DXA 序列进行确证. 采用Lipofectin试剂转染，按其说明书进行转

10、染，同时转 染PcDNA3. 1空载体作为对照.挑选阳性克隆进行扩大培养，加压筛选 2 mo后进行RTPCR鉴定细胞转染结果.用Promega公司RXA提取试剂 盒提取、纯化细胞总RNA,进行总RNA纯度分析后，按试剂盒说明进 行反转录反应，取反转录的cDNA链为模板进行PCR反应.PCR扩增条 件为：95C,预变性2 min,继之以32个循环，包括94C 1 min, 52C 1 min, 72C 1 min,最后72C延伸10 min.分别取PCR产物进行10 g/L琼脂糖电泳，紫外线投射仪观察结果并照相. 胰酶消化体外培养的B16细胞，PBS洗3遍，过200目筛网 得到单细胞悬液，调整细

11、胞浓度为5X109/L,每只小鼠尾静脉注射0. 2 mL, 2 wk后处死小鼠记数肺转移灶个数，设立肿瘤对照组和mGMCSF 治疗组. 统计学处理：结果以x土s表示，各组结果数据应用SPSS11.0 统计软件进行t检验. 2结果 ,插入pcDNA3. 1载体，得到重组质粒pcDNA3. 1/mGMCSF,用 Xhel和Xhol双酶切该质粒，可得到430 bp的mGMCSF片段，与预期 大小相符（图1）. DNA序列分析结果表明，所插入序列完全正确，表 明重组质粒构建成功.2. 2mGMCSF在B16小鼠黑色素瘤细胞中的表 达将重组质粒pcDNA3. 1/mGMCSF转染小鼠黑色素瘤细胞系B16

12、,经过 G418加压筛选，得到能稳定传代的G418抗性细胞系B16TR.为了证实 该细胞系可表达mGMCSF,我们以转染细胞总RNA为模板，行RTPCR检 测，结果显示在该细胞系中可检测到450 bp左右的条带，与mGMCSF 的大小相符，提示B16TR中含有并可表达mGMCSF基因(图2). 2. 3抑瘤效果分别将1X106个转导了 mGMCSF基因的小鼠黑 色素瘤细胞B16TR和未转染mGMCSF基因的肿瘤细胞B16,从尾静脉注 射小鼠，2wk后处死小鼠并计数肺部转移灶的数目，可以看出未转染 mGMCSF组肺部转移灶弥散，大小不一；而mGMCSF基因转染组肿瘤成 瘤性明显下降，表现为肿瘤转

13、移灶的数目和大小明显减少，且有一只 未见肿瘤转移灶发生.t检验显示两组转移灶数目具有显著性差异 (n二5,125. 834. 3 vs 27. 824. 0,P0. 01,图 3).提示 mGMCSF转导可明显抑制黑色素瘤的转移. 3讨论 联合细胞因子用于肿瘤免疫以提高机体的特异性抗肿瘤免疫 功能是一个重要的抗肿瘤免疫策略6-7.我们发现，转染GMCSF 基因的B16注射后的小鼠肺转移结节数明显少于未经转染的肿瘤对照 组，提示经转染有GMCSF的B16细胞的成瘤性降低.我们推测，由于 B16肿瘤细胞内转入GMCSF基因，使细胞因子在肿瘤局部大量产生， 激活了杀伤细胞，诱导机体抗肿瘤免疫效应；同

14、时转入GMCSF基因的 肿瘤细胞易被机体免疫系统识别，从而提高机体自身免疫功能避免肿 瘤逃避免疫监视，启动机体自身主动抗肿瘤能力，最终达到减少肿瘤 发生，降低成瘤率的目的.许多研究结果证实，一些细胞因子可以通 过对肿瘤细胞的修饰来改变其免疫原性，从而诱导宿主特异性抗肿瘤 免疫效应3.基于这些发现，各种细胞因子基因转染的肿瘤细胞用 于治疗的研究应运而生.到目前为止，这些研究几乎涉及到全部与免 疫系统相关的细胞因子8-9 其中GMCSF因具有可增强粒细胞，巨 噬细胞活性，增强MHCI , MHCII, B7分子的表达，增强抗原提呈功能 等广泛的生物学活性，从而可能在肿瘤的免疫治疗中会发挥重要作用

15、5, 10. 我们下一步拟探讨转染GMCSF基因的B16对肿瘤小鼠免疫原性的 直接影响，为将来联合细胞因子的黑色素瘤临床免疫治疗提供进一步 的实验依据. 【参考文献】 1 Chung ES, Sabel MS, Sondak VK. Current state of treatment for primary cutaneous melanoma J Clin Exp Med, 2004, 4(2) : 65-77. 2 Tsao H, Atkins MB, Sober AJ. Management of cutaneous melanoma j . N Engl J Med, 2004, 3

16、51 (10): 998-1012. 3 Stone A, Cooper J, Koenig KL, et al. A comparison of survival rates for treatment of melanoma metastatic to the brain j . Cancer Invest, 2004,22 (4):492-497. 4 Elliott B, Dalgleish A. Melanoma vaccines j. Hosp Med, 2004,65(11):668-673. 5 Shurin MR, Kirkwood JM, Esche C Cytokineb

17、ased therapy for melanoma: preclinical studies j Forum (Genova), 2000,10(3):204-226. 6 Morse MA, Chui S, Hobeika A, et al. Recent developments in therapeutic cancer vaccines j Nat Clin Pract Oncol. 2005, 2(2) : 108-113. 7 Komenaka I, Hoerig H, Kaufman HL Immunotherapy for melanoma j . Clin Dermatol. 2004,22 (3):251-265. 8 Nemunaitis J, Nemunaitis J. Granulocytemacrophage colonys tim ula ting factor gene transfected auto logous tumor cell vaccine: focus correction to fcous on nonsmallcell lung cancer j . Clin Lung Cancer. 2003,5(3):148-57.