硕士论文-ω3多不饱和脂肪酸甘油酯富集的研究

1、江南大学硕士学位论文-3多不饱和脂肪酸甘油酯富集的研究姓名：全文琴申请学位级别：硕士专业：食品科学指导教师：陈洁;陶冠军20080801摘要在酶柱中滞留时间为的工艺条件下，和甘油酯的酯化率分别为和，甘油三酯含量分别为和。甘油酯连续化合成反应的初步研究结果显示，连续化工艺尽管在反应效率上大幅度提高，对于工业化生产应用有一定参考价值，但是在如何提高甘油三酯产率问题还有待于进一步研究。关键词：、；水解；甘油酯；有机相酶催化合成；分离纯化佃），（），（），（）（），：，：（），：，加，仃，”，：；独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别

2、加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。签名：金久务日期捌目形关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。签名：

3、金圣竖导师签名：期：盟一。占，么第一章绪论第一章绪论引言多年来，型多不饱和脂肪酸（）一直是国内外的研究热点，而鱼油与其它油脂不同之处在于鱼油中含有相当多的二十碳及二十二碳的型。二十碳五烯酸（）和二十二碳六烯酸（）是鱼油特别是海产鱼油的特征脂肪酸，它们由于在人体内不能合成而成为必需脂肪酸（，），在人体中具有重要的生物学意义。、分子的结构式如图。（）：（）：图卜、结构式人体中的、主要有两个来源：一是从膳食中获得，这是最主要的来源；二是由亚麻酸（，：）经脱氢酶与链延长酶的作用代谢而来，即。有关和的提取、富集、生理活性及临床应用，很多科研工作者都进行了大量的探索工作。目前对和的生理活性己经明确，它们不

4、仅具有降血压、消除疲劳、预防动脉粥样硬化和脑血栓、抗癌等生理活性，而且能显著地促进婴儿的智力发育，改善大脑机能，提高记忆力，是生产预防心血管疾病和婴儿益智食品的良好基料。和的生理功能增进神经系统功能，益智健脑是视网膜的主要组成部分，约占，和能提供视觉神经所需营养及机能成分，故可防止视力下降，多数中老年患者服用后视力明显改善，补充足够的对活化衰弱的视网膜细胞有帮助，对用眼过度引起的疲倦、老年性眼花、视力模糊、青光眼、白内障等疾病有治疗作用。是人脑的主要组成物质之一，是大脑细胞形成发育及运作不可缺少的物质基础，约占人脑脂肪的左右，且其主要以磷脂形式存在于人脑中，因而在脑细胞膜形成过程中起着重要的作

5、用。实验证明，如果缺乏，脑细胞膜的形成将发生障碍，脑细胞就会死亡。同时，脑细胞上具有重要的、可以传递信息的突起（脑细胞网状组织），维护这个突起不断延伸、长出新的突起，都需要含有的磷脂参与，如果缺乏，突起就会逐渐萎缩，脑细胞间的信息传递能力就会下降，同时还会使感观功能衰退。因此，给大脑补充，可以促使脑细胞突起再度延伸，在一定程度上能达到预防、治疗老年痴呆的目的【】。对提高儿童智力有好处。联合国粮农组织和世界卫生组织早在年推荐的膳食指南中明确规定【】婴儿配方奶粉中必须含有，美、日等发江南大学硕士学位论文达国家己立法规定必须将添加于各类婴幼儿食品中。据中华预防医学会负责人介绍，研究表明【引，我国居民

6、摄入的系列脂肪酸主要是【亚麻酸，和的摄入量非常有限，很多内陆地区居民膳食中几乎检测不出和。因此，积极改善食物结构，增加含有和的海鱼产品的摄入量十分必要。当然，对于那些食用海产品困难，又十分需要增加和的人群，如早产儿，血甘油三酯高的成年人等，可以选择、补充剂。抑制血栓，预防心肌梗塞和脑梗塞大量的人体和动物实验表明【和等型多不饱和脂肪酸在体内经过转化，可产生多种衍生物，具有抑制血小板凝集、增加血小板细胞膜流动性和改变细胞信号作用，从而抑制血栓的形成。能抑制血小板凝聚、减少血栓素形成，具有预防心肌梗塞和脑梗塞的功能。其机理是：与（花生四烯酸）在细胞膜磷脂中竞争性和脂氧酶、环氧酶作用，抑制了的代谢，减

7、少生成，但并不抑制在内皮细胞代谢生成。的代谢产物具有类似的生物活性，降低比值，因而当摄入时，可促进血小板中的生物合成，从而提高血小板内浓度，并降低血浆中钙离子和一羟色胺的浓度。可改善血小板膜流动性，从而改变血小板对刺激的反应性及血小板表面受体数目。根据国外最新的流行病学和临床实验提供的数据【和等一型多不饱和脂肪酸的摄取量和冠心病的发病率呈负相关，岁的男性病例摄取较多鱼肉可降低心脏猝死的危险。等【】对例冠心病患者进行了年跟踪研究，比较摄取鱼类或和等型多不饱和脂肪酸较少的人群和较多的人群发生冠心病和非致命性的心肌梗死的危险性。结果发现每周摄取的鱼类越多，相对危险度越低。在英国对名恢复期心肌梗塞的患

8、者研究发现，吃富含和等型多不饱和脂肪酸的海鱼组死亡率明显低于不吃海鱼组。降血脂和胆固醇，预防和治疗动脉粥样硬化动脉粥样硬化是老年和中年人的常见病和多发病，高血脂是致病的重要因素。大量实验表明，富含和等型的鱼油具有明显的降血脂和降胆固醇效应，不仅有效降低严重高甘油三酯血症患者的甘油三酯，而且可降低餐后高甘油三酯血症，并可以有效治疗混合型高脂血症【。一般认为，和降血脂的机理是增加胆固醇的排泄，抑制内源性胆固醇合成，改变脂蛋白中脂肪酸的组成，从而增加其流动性，减少极低密度脂蛋白中的甘油三酯及载脂蛋白的合成，抑制人单核细胞产生血小板活性因子。高密度脂蛋白（，）可逆向转运胆固醇，因而具有抗动脉粥样硬化的

9、作用，而低密度脂蛋白（，）转运内源性胆固醇，被认为是动脉粥样硬化独立的危险因子。研究表明，和等型具有降低胆固醇和（极低密度脂蛋白）胆固醇，增加胆固醇的作用。多数实验研究显示，和等型可以延缓动脉粥样硬化的进程。第一章绪论日本一项流行病学研究结果表明，农村居民动脉粥样斑块数是渔村居民的倍，且和等型与颈动脉斑块数呈负相关【】，一型斑块数呈弱的正相关。一项尸检研究显示，爱斯基摩人血管内膜脂质条纹和呈现的损害更少，且在低龄时期脂质条纹与内陆居民的区别更大【】，脂肪组织中的脂肪酸组成，可以客观的反映从食物中摄取的脂肪类型。等研究发现冠状动脉病变的程度和脂肪组织中浓度和体重呈负相关。例经冠状照影证实为冠心病

10、的患者，每天摄入的和等型，年后结果表明型的摄入减缓了冠状动脉粥样硬化的进程引。降血压降压实验表明，增加脂肪组织中的亚油酸不影响正常人的血压，而每增加的【亚麻酸则使平均动脉压下降。用含不同脂肪酸的饲料喂食自发性高血压的幼鼠发现富含仅亚麻酸的饲料可使幼鼠舒张压比其它幼鼠低。小时动态血压监测显示，每天摄入和等型周，可使收缩压下降，舒张压下降。和等型的降压作用可能是降低内源性血管活性物质（如去甲肾上腺素）对血管的反应，也可能是前列腺素的直接作用【引。抑制肿瘤流行病学调查发现，以海产物为主食的爱斯基摩妇女，因乳腺癌而死亡的人非常少。鱼油中和均具有抑制直肠癌的作用，而且的抑制效果更强。还可降低治疗胃癌、膀

11、肤癌、子宫癌等抗肿瘤药的耐药性，并且高纯度可抑制大肠粘膜上产生异常腺窝的生长。因此富含和的鱼油可抑制癌细胞的发生、转移及降低肿瘤生长速度，给医治癌症带来了新的曙光【引。抗炎，抑制过敏反应爱斯基摩人很少患喘息性气管炎、关节炎等慢性炎症疾病。同时实验发现，饲喂的动物，其实验性炎症的水肿程度降低。其抗炎作用机理主要是抑制中性细胞和单核细胞的脂氧合酶代谢途径，增加白三烯（，几乎无生理活性）的合成，同时抑制（由产生，具有强的收缩平滑肌与致炎作用）介导的中性白细胞机能，并通过降低白介素的浓度而影响白介素的代谢。由以上几个方面可看出和的生理作用是不同的。在增进神经系统功能，可以预防老年痴呆、保护视力方面、抑

12、制肿瘤方面效果比好。而在防治心脑血管疾病、炎症方面的效果比好，主要分布和作用于外周心血管系统。、的富集方法从天然海产鱼制得的多不饱和脂肪酸中，和的含量随鱼的种类而不同，通常在之间，而的总含量则常在之间，这样低的含量并不能满足现代保健品的要求，故近年来，制药及保健食品行业纷纷根据长链一的物理和化学性质对其进行提纯富集。一般鱼油中的分离和精制的方法主要可分为传统理化方法和酶法两大类。江南大学硕士学位论文传统理化方法富集低温冷冻法饱和脂肪酸在有机溶剂中的溶解度与碳链的长度成反比，不饱和脂肪酸的溶解度随不饱和双键数目的增多而加大。在低温条件下，很多饱和及低不饱和脂肪酸会以结晶析出，过滤后可得浓缩的多烯

13、脂肪酸。常用溶剂为丙酮和甲醇，本法也适用于脂肪酸甘油三酯的分离（因甘油三酯结合的三个脂肪酸可能不同，因此可能造成有效成分的部分流失）。有报告指出饱和脂肪酸在。以下几乎不溶，低不饱和脂肪酸在。以下也几乎不溶，而、在。时还能保持液态。低温结晶法具有设备简单，操作方便安全，有效成分不易变性的优点，但该法需使用大量有机溶剂，而且溶剂有残留，产率较低，不适合大规模生产。金属盐沉淀法多烯脂肪酸盐在有机溶剂中的溶解度高于饱和脂肪酸盐，上一世纪年代英国科学家就采用脂肪酸锂盐沉淀法分离并鉴定出。本法是分离脂肪酸的经典方法之一，其中钠盐丙酮法及锂盐丙酮法应用较广泛。此法操作简单，大多工序是在常温下完成，无需使用大

14、量的有机溶剂，选择性强，成本较低，是分离鱼油多不饱和脂肪酸的一个比较常用的方法【】。但金属盐离子的回收比较麻烦，对环境的污染较大，这是该方法的一大不足。尿素包合法尿素可形成具有管道的六面体结晶，直链脂肪酸可进入管道中形成尿素包合物，不饱和脂肪酸由于存在多个双键导致分子体积增大而不能进入管道。、含有个和个双键，很难与尿素形成稳定包合物，而鱼油中的饱和及低不饱和脂肪酸可进入六面体管道并与尿素一同析出。就其按饱和程度差异分离脂肪酸的能力来讲，本法优于按碳链长短差异分离脂肪酸的各类方法。脲包法的工艺成熟，所需设备简单，操作也不是很复杂，因此成本较低。脲包法的缺点是不能将碳链长度不同而不饱和度相同和相近

15、的多不饱和脂肪酸分开，和中含有一部分：、：、：等多不饱和脂肪酸，而且滤液中有脲存在，必须加以除掉。分子蒸馏法即在高真空条件下进行的蒸馏，在此条件下分子运动可克服其间的引力，因而分子挥发极其自由，理论沸点几乎不存在【】。、可在大大低于其正常沸点的情况下蒸出，从而得到较纯的产品。但是，此法需要经过反复多次操作才可提高纯度，并且。左右时间较长可能使、产生异构体而变为对人体有害的物质，且不能将分子量与和相近的脂肪酸，如二十碳酸、二十二碳酸，以及它们的一、二、三、四烯酸分开，而这些长碳链饱和酸和一烯酸都是所不希望的，尤其是：（芥酸类），在室温下它是固体不为人体所吸收，被认为是对人体有害的成分。第一章绪论

16、超临界气体萃取法此法的原理是在临界状态的某些气体（如等），虽呈气态但密度却近似液体，具有良好的溶媒性质，可将天然原料中的有效成分萃取出来。由于等气体无毒无味，不会污染制品，因此比较适于工业生产。但分离碳原子相近，双键数目相近的脂肪酸比较困难憎。高效液相色谱法（）反相高效液相色谱法是分离纯化和最为有效的方法。其原理是利用含不同双键数和不同碳原子数的脂肪酸因极性上的差异，在固定相和流动相之间的分配系数不同来进行分离的【。上述种分离方法虽然各有优缺点，但是一点是共同的，即它们只能将多不饱和脂肪酸与饱和、低不饱和脂肪酸大致分开，却不能得到高纯度的和的单一组分。而法具有灵敏度高、分辨率强、回收率高、纯化

17、过程条件温和，可获得高纯等诸多优点，必将成为提纯、的首选方法，可集分离纯化检测鉴定于一体，极大地提高了纯化效率。由于固定相可反复利用，且制备可处理大量原料，因此，也适用工业化规模生产。在日本已有人用大型的制备柱来进行生产高纯的和。酶法富集为了提高和的保健和医疗效果，众多研究者将甘油酯中的和转酯化或者水解转化为相应的乙酯或者游离形式，然后再通过各种物理或者化学方法提高和的含量，以此来增强和的保健功效。年美国的研究人员通过大量实验后，发现和的甘油酯型、乙酯型和游离脂肪酸型在人体内消化吸收有差异。】等研究的结果也表明，和乙酯型在人体中不仅消化和吸收比较困难，而且可能存在安全隐患：游离型的和虽然易于被

18、人体消化和吸收，但是容易氧化生成对人体有害的物质，而且有酸味、口感不好，直接作为食用难以被人们接受；和的甘油酯型不仅性质稳定、不易氧化、口感好、易被人体消化吸收，而且是和的天然存在形式，因此和的甘油酯型是保健品和药品的最佳产品型式。再者，随着人们生活水平的提高，消费者不再满足天然鱼油甘油酯型保健品中和含量低的现状，期望提供安全性好，和含量高的甘油酯型保健品。近年来，利用微生物酶富集和的方法逐渐受到人们的重视。与物理和化学方法相比，酶法有一系列的优点，首先，酶催化效率高，在大规模的生产中用量很少，且固定化酶能多次的重复利用；再则，酶催化反应在温和的、温度和压力下进行，这对不稳定的长链和来说尤为重

19、要。在通常的理化反应条件下长链和中顺式结构双键被氧化、顺反异构、双键的移位和聚合反应都易发生；因此，利用酶工程技术将和富集在甘油酯上是一种非常有效的方法。脂肪酶法富集和甘油酯又分为脂肪酶选择性水解、脂肪酶选择性酯交换和脂肪酶选择性酯化等【】。江南大学硕士学位论文脂肪酶选择性水解法脂肪酶催化水解鱼油中的甘油三酯，可以得到以酰基甘油形态存在的和浓缩物或游离态的和。通常认为鱼油的甘油三酯中位上连接着和等，位上连接着饱和的和低度不饱和脂肪酸，这样其分子由上而下的三个酯键（，）有空间差异。有的脂肪酶具有，位置选择性，利用酶的位置选择性水解掉，位上的饱和的或单不饱和的脂肪酸，从而使富集在甘油酯的位上。有的

20、脂肪酶虽然对甘油酯无位置选择性，但对酰基碳链有选择性，就可水解掉任何位置的非脂肪酸，得到富含的甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯的混合物。等人【】的研究阐明了脂肪酶的这种选择性与鱼油中的长链的一不饱和脂肪酸对脂肪酶水解作用的“抵制机制”有关。由于不饱和脂肪酸分子中存在碳碳双键和全顺式构型，引起整个链的弯曲，因此在甘油酯分子上不饱和脂肪酸中靠近酯键的最末端甲基对脂肪酶的进攻形成空间阻碍。和分子中分别有五个和六个双键，导致全顺式构型的整个链高度弯曲，加强了这种空间阻碍作用，使得脂肪酶难以接触到和与甘油形成的酯键，故脂肪酶对甘油酯上的和酰基作用较弱。但饱和的和单不饱和的脂肪酸在空间上对酶分子不存在这样的空

21、间阻碍，因而很容易被水解掉。利用脂肪酶水解法富集和甘油酯，国外已在世纪年代开展了大量的研究工作，我国是在年后才有资料报道这方面的研究。但是到目前为止，还没有高含量的和甘油酯产品上市。通过脂肪酶的选择性水解来富集和甘油酯，关键是要筛选出具有良好选择性的脂肪酶和控制好水解过程参数。等【】人对多种商业化的脂肪酶进行筛选，发现柱形假丝酵母脂肪酶水解富集和的效果最好，可使海豹油中和含量提高至，使鲜鱼油中和含量提高至。，】等人在筛选六种脂肪酶的选择性水解金枪鱼油的能力中发现也是柱形假丝酵母脂肪酶水解富集和的效果最好，甘油酯中含量增加了倍，而其它五种酶，并没有使含量明显增加。等用四种脂肪酶选择性水解富集，发

22、现通过高度水解来富集鱼油中的是困难的。等人在研究中阐述了脂肪酶对，位的特殊选择性的重要性。为了增加选择性水解富集和的效率，研究者采用了各种办法，【，等采用逐步酶水解法，第一步水解后，用物理的方法除去游离脂肪酸，剩余的甘油酯进一步用脂肪酶在同样的条件下再水解，甘油酯中和含量可增加至，得率为。等人以从蛙鱼内脏中提取的鱼油为原料，用种脂肪酶催化水解富集和甘油酯，结果发现来自洋葱假单胞菌（）和假丝酵母（）脂肪酶的富集效果比较好，可使原料鱼油中和含量增加两倍。等】人用假丝酵母（）脂肪酶选择性水解沙丁鱼油，和在甘油酯中含量分别由和增加至和。等【人利用表面活性包裹的假丝酵母（）脂肪酶在水油两相中对金枪鱼油进

23、行选择性水解，结果甘油酯中的含量由原来的增加到，含量由原来的增加到。第一章绪论在我国，石红旗等【人研究了以国产解脂假丝酵母（）脂肪酶在适宜的条件下水解鱼油，制备了的富含和的甘油酯产品，和含量分别为和，总含量为，甘油酯产品经高效液相色谱分离、红外光谱分析确证为甘油酯混合物，包括单甘油一酯（），甘油二酯（）和甘油三酯（）种形态。吴可克等【人以蟾鱼油为原料，研究了国产假丝酵母（）脂肪酶的选择性水解条件，结果表明在适宜条件下鱼油中的和含量由原来的和增加至和。吴可克等【】人还以深海鱼油为原料，脂肪酶为催化剂，尝试了搅拌式反应器、渗透膜反应器、中空纤维式反应器对鱼油的选择性水解反应的影响，结果表明带有固定

24、化酶的搅拌式反应器对酶促鱼油部分水解反应为最适反应器。王运吉等【】人以聚氨酷泡沫为载体，采用固态培养的方法固定化细胞，研究了固态培养条件和固定化胞内脂肪酶的性质及其在选择性水解鱼油富集中的应用，结果表明：在最佳条件下，固定胞内脂肪酶与非固定化的自由菌丝胞内脂肪酶相比，前者水解活力提高了以上；和热稳定性也显著提高；半衰期为；酶法选择性水解鱼油，由提高到以上。郑毅等【】人通过对种不同来源脂肪酶的筛选，以来源于米曲霉脂肪酶为最佳酶种，在该酶的最佳水解鱼油的条件下，鱼油中和分别由和提高到和。脂肪酶选择性酯交换法脂肪酶选择性酯交换法是通过选择不同活力的脂肪酶，使鱼油中的甘油酯与游离的、醇或另一酯发生的酰

25、基交换反应，结果使鱼油中的较多的分布在甘油酯中，达到富集的目的【。酯交换可分为三个过程：酸解、醇解、酯酯交换。酸解富集是利用脂肪酶的选择性将连接在，位的饱和脂肪酰基和单不饱和脂肪酰基与高浓度的发生酰基交换作用，从而将富集在甘油酯上。等【】在底物比：（鱼油）、固定化脂肪酶、水分含量的条件下，经酸解富集甘油酯中一含量增至。】等在利用酸解反应中发现鱼油中含量在前是下降的，而含量在正常酸解反应中是增加的，可能是由于鱼油中被所取代而达到一个新的平衡。为增加反应的效率，等【】采用两步酸解法，首先在超临界中进行，然后在真空下进行，这样可使甘油二酯的含量减少；通过一套由水套式填充柱和底物混合器（温度保持在或）

26、中间由管道连接组成的循环装置可从反应混合物中除去结晶的饱和和单不饱和的脂肪酸，从而提高的含量。等【】还研究了将酶水解和酸解联合应用富集中，认为将可以富集到一些有价值的植物油中，生产出具有更高利用价值的构造脂质。在酸解反应中，水分含量和酶活性是影响反应效率的两个重要参数。如果底物中水分含量太高，酸解会向水解的副反应方向进行；另一方面如果水分太低，它又会影响酶活性。这种双重效应使得酸解反应将富集在甘油酯中的效率比较低，这是酸解反应的一个最大缺点。虽然酸解富集可以将甘油酯中的含量提高到左右，但是需要较高浓度的为前提。因此醇解富集为提高江南大学硕士学位论文甘油酯中的含量提供了另外一个技术途径。醇解富集

27、（的机理和水解一样，利用脂肪酶的，位置选择性，使连接在，位的饱和脂肪酰基和单不饱和脂肪酰基与一些短链的脂肪醇发生酯化作用，从而将富集在甘油酯上。等【】在脂肪酶、一定量的乙醇、和反应的条件下，甘油酯中的含量增至左右，和的回收率分别是和。掣认为脂肪酶在一定量的乙醇中可能会失活，为了避免这种情况发生，采用逐步加入乙醇的方法，第一步醇解在、量的乙醇、固定化脂肪酶的条件下反应，乙醇被消耗，的金枪鱼油被转化为相应的酯；第二步，加入剩余的乙醇，反应，经过逐步醇解的金枪鱼油被转化为相应的酯。在醇解反应中，水分含量和脂肪醇的类型是影响醇解效率的两个关键因素。等【人对十种醇进行醇解筛选，发现异丙醇和乙醇用于醇解最

28、合适，也有研究者认为月桂醇最合适。酯酯交换反应是利用脂肪酶选择性催化甘油酯中，位的酰基与的乙酯发生酰基交换反应，得到含量更高的甘油三酯。目前关于这方面的报道不是很多。脂肪酶选择性酯化法脂肪酶选择性水解法和脂肪酶选择性酯交换法由于受天然鱼油中含量低的限制，使得在甘油酯中的含量仍然得不到较大提高，因此脂肪选择性酯化就成为提高一在甘油酯中含量的一个新的重要技术途径。脂肪酶选择性酯化是指脂肪酶选择性的催化游离脂肪酸中与甘油反应生成甘油酯，而富集在甘油酯分子上，从而达到富集的目的。这种方法一般先使鱼油完全水解，浓缩富集制得高纯度的，再在脂肪酶的催化下与甘油发生酯化反应【。利用此法可得到含量达以上的甘油酯

29、。等【卜】研究在酶催化酯化反应中强调使用有机溶剂的重要性，选择合适的有机溶剂体系可为底物提供均一的系统，改变酶分子对底物的选择性和亲和力，产生各种各样的物理化学效应。等【】对甘油和在有机溶剂体系中的酯化反应进行了深入研究，脂肪酶的酯化度达到了，由于该酶具有，位置选择性，产物主要以甘油二酯为主，而甘油三酯含量较少。等【】在对脂肪酶、和进行催化合成研究中发现，脂肪酶的酯化度达到了以上，该酶具有宽广的专一性，产物中甘油三酯的含量达到，分析的含量达到以上。等【】对多种脂肪酶进行酯化反应筛选，发现来源于染色粘性菌（）的脂肪酶酯化富集的效果最好，在异辛烷体系和最佳工艺水（甘油）、底物：（），酶，反应条件下

30、酯化率为。等【在无溶剂系统中进行酯化反应富集，添加的脂肪酶，在真空、下反应，的酯化率为，若反应时间延长为，酯化率可达。等【】认为脂肪酶对有较好的选择性，将该酶固定在碳酸钙粉上，在真空条件下反应，的酯化率为。体系中水分含量影响着第一苹绪论反应的平衡和酶的活性，因为水是反应的产物，大量水的生成又会导致己富集了的甘油酯重新发生水解，分子筛的加入可以有效除去多余水分提高酯化率。影响酯化反应的因素较多，为更好的控制反应过程参数，等【】利用响应面优化方法对酶法合成的过程参数进行了优化，在最佳的因素水平组合下，酯化度达到了。以上的研究都表明酶促合成法很容易将富集到甘油酯中，酯化度可达以上，甘油酯中的总含量可

31、达以上。脂肪酶选择性水解和脂肪酶选择性酯交换，这两种方法所获得的甘油酯产品中和的含量一般不超过，并且和是混合在一起的，由于两者在生理功能上的差异以及含量的限制，这类产品受到一定的应用限制，要获得高浓度的产品，脂肪酶选择性酯化是一条有效途径。立题背景与研究内容立题背景与意义目前市场上的、制品主要分为两类：一类是含量在左右的甘油酯型式，另一类是含量在一左右的乙酯形式。这两类产品都有一共同的缺陷，即和是混合在一起的，没有进行分离，而且含有较多的人体不需要的其它成分，和浓度不高。尽管和都是对人体有益的多不饱和脂肪酸，但他们的作用有较大差别。以健脑、增强记忆力和提高视力为目的的婴幼儿、青少年孕妇等群体应

32、服用以为主不含或少含的产品，而以降血脂、防治动脉粥样硬化等心血管疾病的群体则应服用以为主的产品。因此，不同的使用对象、不同的使用目的，对、的要求是不一样的，依据和生理功效的差异，从充分发挥和各自保健功效的角度考虑，将鱼油中和分离，分别进行开发利用，将很好地改善产品的应用针对性。另外，从提高人体的吸收，充分发挥制剂的功效来说，和产品纯度越高越好，这不仅可提高疗效，而且还可减少不必要的副作用。和主要以甘油酯的形式存在于深海鱼类的脂肪组织中，一般和总含量为。在过去，由于天然型的鱼油所含和的浓度较低；而脂肪酸乙酯型易得到高纯度的产品，研究者们多偏重于对和乙酯型的研究，而对其甘油酯型产品研究相对较少。但

33、是近年来，对鱼油保健品，人们对其剂型为脂肪酸型、甲乙酯型的安全性提出了质疑，不再满足于天然鱼油甘油酯型保健品中和含量低的现状，期望提供安全性好、和含量高的甘油酯型保健品。另外，和甘油酯在消化道中的水解速率比物理或化学方法富集得到的相应的甲酯或乙酯快，和的甘油酯比其甲酯或乙酯更适合机体吸收。有研究表明，天然的甘三酯形式最符合配药学形式，比如的甘三酯（）用于抑制血栓的制剂【；等人【】也认为对于婴儿应用上来说，甘三酯的形式也是最适合的，因为母乳中的是以甘油三酯的形式存在的。从市场角度考虑，和的单酰、双酰和三酰甘油酯将因为比相应的游离脂江南大学硕士学位论文肪酸和烷基酯更“天然而畅销。因此，和的甘油酯产

34、品将是未来鱼油保健品的主要发展趋势，我们必须加强对这项技术的开发力度，争取有自主知识产权的专利技术，为开发高含量和甘油酯型鱼油保健品提供理论基础；另外，近年来随着捕捞强度增大，海洋渔业资源逐年衰减，海洋捕捞的中低值鱼产量呈上升趋势，占海洋捕捞产量的，大部分用于生产饲料，产品的附加值低，企业经济效益低下，还有一部分资源被抛弃掉，这不仅浪费资源，而且污染环境。因此，该项目的关键技术也可为低值鱼资源的高效利用提供很好的技术途径，这对于高效利用海洋生物资源生产高附加值产品和促进海洋经济发展都具有积极和重要的现实意义。主要研究内容本研究以鱼油为原料，采用化学水解法和酶催化法水解鱼油，将和从甘油酯的形式中

35、释放出来，通过填料的层析柱，洗脱液逐步洗脱分离、及其它非目标组分，获得和的纯度较高的样品，再进一步利用酶法富集和的甘油酯产品，并对其反应条件、反应机制等进行一系列的探讨和研究；同时，对和甘油酯的连续化合成工艺进行了初步探索研究。该研究将不仅丰富水产品综合利用和油脂酶法改性的理论，而且也将为开发新一代的鱼油保健品提供技术途径，为鱼油产品的进一步开发、应用和工业化生产提供了可能性。另外，本项目的研究成果对于其他酶催化酯化合成技术的工业化也具有理论参考价值和借鉴意义。具体研究内容与方法如下：探讨了和的反相高效液相色谱快速分析方法，对其方法学进行考察，并将该测定方法与传统的气相色谱分析法进行比较；探讨

36、从鱼油中获得高产率多不饱和脂肪酸的方法，主要以化学法和酶催化法为主进行研究，探讨两种水解方法的水解效率，通过单因素实验确定化学水解较佳的工艺条件：并以水解的样品通过柱层析制备纯度较高的多不饱和脂肪酸（和）样品；以较高纯度的多不饱和脂肪酸和甘油为底物，采用酶催化合成方法，研究间歇反应合成多不饱和脂肪酸甘油酯的条件；并通过质谱和核磁分析验证了多不饱和脂肪酸甘油三酯的结构；初步探索了连续化合成多不饱和脂肪酸甘油酯的工艺条件。第二章法直接测定、游离酸的方法研究第二章法直接测定、游离脂肪酸的方法研究引言近年来，测定鱼油中和常用的检测方法有气相色谱法和液相色谱法。因深海鱼油中的脂肪酸是以甘油酯的形式存在的

37、，沸点较高，不利于气相色谱分析，因此对深海鱼油样品进行总脂肪酸含量以及对各脂肪酸组分的分析测定前必须对样品进行前处理，目前运用最广泛的就是采用甲基酯化法将甘油酯转化为甲酯后进行气相分析，。液相色谱法用于分析深海鱼油中的多不饱和脂肪酸国内也有少量报道，但也都要经过衍生化处理，一是通过皂化酯化后进行液相分析，也有报道是通过荧光试剂柱前衍生进而再通过液相分析【。总的来说液相色谱分析时间比气相色谱更短，分离度良好。这两类报道的方法一般是应用于鱼油样品中总脂肪酸的测定，样品需要衍生化处理，处理步骤多，过程复杂。由于本实验所用材料是经过处理的精炼鱼油，其中含量较高，杂质相对较少，同时为了减少在前处理（如酯

38、化等）过程多不饱和脂肪酸的损失，快速测定鱼油水解液中的，本研究充分利用液相色谱的分离和定量能力，在水解出、的游离酸后不经过衍生化的前处理，直接进行分析，并以的标准品为参照，进行分析条件的优化和方法学的考察，同时与国标气相方法进行比较。该直接检测方法节省了样品准备时间和分析时间，有利于及时监测鱼油水解过程。实验材料及方法材料试剂名称，标准品正己烷无水硫酸钠甲醇无水乙醇盐酸甲酸鱼油样品固定化脂肪酶纯度级别生产厂家美国公司分析纯中国医药集团上海化学试剂公司分析纯中国医药集团上海化学试剂公司色谱纯中国医药集团上海化学试剂公司分析纯中国医药集团上海化学试剂公司分析纯中国医药集团上海化学试剂公司分析纯中国医药集团上海化学试剂公司中国医药集团上海化学试剂公司浙江海洋学院诺维信（中国）生物技术有限公司仪器名称型号高效液相色谱系统质谱检测器水浴恒温振荡器