实用pcr流程表

1、检验日期： 检验项目：HBV-DNA扩增仪中保存文件名 临床PCR佥验流程记录表 使用说明：严格按单一流向进行实验，即试剂准备区-标本制备区-扩增区，严禁逆向移动。本记录表的流向亦遵循此流程；各项 工作执行后在相应项目前的方框内打“V”；本记录表最后归档保存在 PCR实验室扩增区的专用文件夹中，以备查找。 实验前准备 试剂在有效期内扩增仪、加样器、金属浴、温湿度计等仪器在校准有效期内（校准之日起1年） 生物安全柜的滤膜在使用有效期内离心管、带滤芯吸头已经过质检合格 各区按消毒液配制 SOP配制500mg/L含氯消毒液、2000mg/L含氯消毒液和70%酒精，即用即配。 打开通风设备 操作者 试

2、剂准备区 实验前：更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭） 冰箱温度：冷藏室（28C）C； 冷冻室（-20 2C）C 实验室温度C （允许范围：1530C）;相对湿度：（允许范围：30%70%） PCR试剂来源：试剂厂家：口 深圳匹基生物工程有限公司批号： 检验项目：HBV-DNA 本次实验用量：人份；剩余量：人份 其他有关试剂配制： 仪器设备使用： 离心机：正常不正常；振荡器：正常 不正常； 生物安全柜：口正常 口不正常 实验后：口按实验室清洁消毒 SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上。 按实验室废弃物

3、处理 SOP处理实验废弃物。 操作者 检验日期： 检验项目：HBV-DNA 样本处理区 实验前：更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭） 冰箱温度：冷藏室（28C） C； 冷冻室（-20 2 C） C 实验室温度 C （允许范围：1530C）；相对湿度： （允许范围：30%70%） HBV-DNA阳性室内质控物来源： 浓度及批号： 扩增位置： HBV-DNA阴性室内质控物来源： 批号： 扩增位置： 所处理的HBV-DNA标本（对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置: 核酸提取及加样过程：按乙型肝炎病毒 DNA荧光定量PCR操作程序SOP进行。

4、 仪器设备使用：生物安全柜：正常 不正常；恒温金属浴：C； 离心机：正常 不正常；振荡器：正常 不正常； 低温离心机：制冷：正常不正常； 离心：正常不正常 实验后： 口按实验室清洁消毒 SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上。 按实验室废弃物处理 SOP处理实验废弃物。 口使用后标本冷冻保存 3个月，以备复查。 操作者 扩增及产物分析区 实验前：更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭） 实验室温度 C （允许范围：1530C）；相对湿度： （允许范围：30%70%） LightCycler扩增仪操作：开机自

5、检及运行正常；按LightCycler操作使用SOP进行编程、参数设定 HBV-DNA 标准曲线计算值:Slope 值： Intercept 值： r2 值： 室内质控结果：阴性质控物结果： ;阳性质控物结果： 口填写室内质控记录、质控图；是否失控：口否 口是 室内质控结果： 阴性质控物结果： ;阳性质控物结果： 口填写室内质控记录、质控图；是否失控：口否 口是 失控原因及分析：（失控判断标准及原因分析按室内质控SOP进行） 实验结果：见所附扩增仪打印结果 实验结果有效性判断：有效 无效（依据实验结果有效性判断SOP进行） 实验后： 口按实验室清洁消毒 SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心

6、机，并进行紫外线照射30分钟以上。 按实验室废弃物处理 SOP处理实验废弃物。 操作者 1. 操作步骤： 1.2.1取n个的灭菌离心管，作好标记。（n二样本数+1管HCV阴性对照+1管HCV强阳性 对照+1管HCV临界阳性对照） 1.2.2 向上述离心管中分别加入 25ul 蛋白酶溶液。 123分别加入待测样本、HCV阴性对照、HCV临界阳性对照和HCV强阳性对照各200ul. 124加入200ul新鲜配制的裂解液工作液，盖上盖子，振荡15秒，充分混匀。（注意： 不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中） 。 1.2.5 56 摄氏度温浴 15 分钟。瞬时离心，以去除管盖上的滴液。 1.2.6

7、加入 250ul 无水乙醇，盖上盖子，彻底混匀（振荡 15秒） 。在室温下静置 5分钟 （ 15-25 摄氏度）。注意：如果环境温度超过 25 摄氏度，无水乙醇需预冷。瞬时离 心，以去除管盖上的滴液。 1.2.7将n个核酸提取柱放入收集管中，小心地将步骤1.2.6中的液体移入核酸提取柱中。 盖上盖子， 6000*g 离心 1 分钟。倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管 中。（如果离心后核酸提取柱中仍有部分液体，以更高的速度再次离心，确保提取 柱中无残余的液体） 1.2.8小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液1，盖上盖子，6000*g离心1分钟， 倒掉收集管中的废液，将提取柱重新

8、放入收集管中。 1.2.9 小心的打开核酸提取柱的盖子， 加入 500ul 洗液 2，盖上盖子， 6000*g 离心 1 分钟， 倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。 1.2.10 小心的打开核酸提取柱的盖子，加入 500ul 无水乙醇，盖上盖子， 6000*g 离心 1 分钟，丢弃收集管，将提取柱放入新的收集管中。 1.2.11 20000*g高速离心3分钟，彻底去除乙醇。 1.2.12 丢弃收集管，将核酸提取柱放入干净的离心管中，打开提取柱的盖子， 56摄氏度温浴3分钟，以彻底去除残余的液体。 将核酸提取柱放入另一干净的离心管中，小心打开提取柱的盖子，加入60ul洗脱液（请 将洗

9、脱液加到膜的中央），盖上盖子，室温静置5分钟。20000*g高速离心1分钟收 集滤出液，做好标记，4摄氏度保存备用。提取的病毒核酸应在 2小时内用于PCR 扩增，或在-70摄氏度下可以保存一个月 2. 扩增试剂准备（PCR前准备区） 从试剂盒中取出HCV RT-PC反应液、Enzyme Mix，在室温下融化后，2000*g离心5 秒。设所需要的PCR反应管数（玻璃毛细管）为n （n二样本数+1管空白对照+1管HCV 阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照+4管HCV定量标准品），每个 测试反应体系配制如下表： 试剂 HCV RT-PC反 应液 En zyme Mix 用量 n

10、*13ul n *2ul 计算好各试剂的使用量，加入到一适当体积试管中，充分混匀均匀后2000*g离心10 秒，向各玻璃毛细管中分装15ul，转移至样本处理区。 3. 加样（样本处理区） 吸取10ul样本处理步骤1.2.13中收集得到的RNA溶液及HCV定量标准品分别加入到 上述反应管中（空白对照直接加入 10ul洗脱液），盖紧反应管管盖，连同Roche专用 金属反应管套放在离心机中，于2000*g离心10秒，将毛细管转移到检测区。将毛细 管排放好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。 4. RT-PCRz应（检测区） 循环条件设置 Program Cycles Temperature I

11、n cubati on Temperature Acquisitio Anal 摄氏度 Time(mi n:sec) Tran siti on n ysis Rate（ 摄氏度/sec） Mode Mod e 1 1 50 30:00 20 None Non e 2 1 95 15:00 20 None Non e 3 45 95 00:05 20 None Qua n tific ati on 50 00:30 20 Si ngle 72 00:20 10 None 反应体系为25ul.具体设置方法请参照各仪器使用说明书 4.2仪器检测通道选择 选择F1检测通道：HCV内对照（IC）选择F2

12、检测通道。 4.3样本的设定 在扩增开始前条件设定时，将 HCV定量标准品设为“ Standard”并输入试剂盒内给 定浓度值，待检样本和对照品设定为“ Unknown ”。 结果分析条件设定 1. 对HCV的曲线和HCV内对照（IC）的曲线进行分别分析。 2. 分析方式选择Fit Points，基线调整选择 Arithmetic,阈值（threshold ）设定原则以阈 值线刚好超过正常HCV阴性对照曲线的最高点，且正常 HCV阴性对照病毒滴度为 ml为准。具体设置方法请参照各仪器使用说明书。 质控标准 1. 将HCV定量标准品1-4的浓度值输入，仪器将自动以HCV定量标准品的浓度值为横坐

13、标，以其实际测得的外标Ct值为纵坐标给出标准曲线，标准曲线的拟和度绝对值应大 于等于，四个HCV定量标准品的Ct值都应v,否则视为定量结果无效。 2. HCV阴性对照、空白对照HCV RNA应为ml; HCV强阳性对照HCV RNA应为+07IU/ml ； HCV临界阳性对照应为+05 IU/ml ;且HCV阴性对照、HCV临界阳性对照中HCV内对 照（IC）的Ct值都应小于等于33,否则此次实验视为无效。所有实验从样本处理开始 重做。 结果判断 1. 检测样本中+03 IU/ml小于等于HCV RNA小于等于+07 IU/ml，测定结果有效，可直接 报告相应的浓度值。 2. 检测样本中HCV RNA大于+07 IU/ml，可按实际测得值报告相应的病毒滴度，亦可将 该样本用正常人血浆按 10倍梯度稀释到本试剂盒定量检测线性范围内后重新测定, 测定结果应以稀释倍数进行校正。 3. 检测样本中ml小于HCV RNA小于+03 IU/ml，且HCV内对照（IC）的Ct