第一章核酸的制备

1、 核酸凝胶电泳是分子克隆核心技核酸凝胶电泳是分子克隆核心技 术之一，用于分离、鉴定和纯化术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或或 RNA片段。片段。 优点：优点： （1）便于分离）便于分离; （2）便于检测）便于检测; （3）便于回收。）便于回收。 第四节第四节 核酸样品的分析与检测核酸样品的分析与检测 一、核酸样品的凝胶电泳分析一、核酸样品的凝胶电泳分析 (一)凝胶电泳检测核酸的基本原理 核酸分子在中性或偏碱性的缓冲系统中带负电，在电 泳过程中，核酸分子从负极向正极移动，并按核酸构型和 分子大小分离开。电泳后用染料染色。 由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质， 电泳迁移率（或迁移速度

2、）与分子的摩擦系数成反比。而 摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数。 因此，可在同一凝胶中、一定电肠强度下、可在凝胶 上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核 酸分子。 琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳 （二）琼脂糖凝胶电泳（二）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取来的，为一种 聚合线性分子，一般含有多糖、蛋白质和盐等杂质， 杂质的含量每个厂商和批号的产品不尽相同。对DNA 电泳迁移率的影响也不一样，经化学修饰后熔点降低 的琼脂糖叫低熔点琼脂糖，其机械强度无明显变化， 主要用于DNA的限制酶原位消化、DNA片段回收以及 小DNA片段（10500 bp）的分离。琼脂糖凝胶的

3、孔 径取决于琼脂糖的浓度。 琼脂糖可以形成各种形状、大小的孔隙度 。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不 同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近 50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在 强度和方向恒定的电场下电泳。 (1)凝胶缓冲液和电泳缓冲液 TBE,TAE TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时 凝胶的阳极一侧将发生酸性化； TBE比TAE花费稍贵，但 有高得多的缓冲容量。 双链线状DNA片段在TAE中比在TBE中迁移快10%。 对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE， 对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE 中的电泳分辨率要好于TB

4、E。 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移 率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最 小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10 电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔 化或DNA变性。 不同类型琼脂糖分离不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围片段的范围 浓浓 度度 （%） 标标 准准 (kb) 高强度高强度 (kb) 低熔点低熔点 (kb) 低黏度低低黏度低 溶点溶点(kb) 0.3150 0.50.725 0.80.5150.8100.810 1.00.25120.480.48 1.20.1560.370.37 1.50.0840.240

5、.24 2.00.130.13 3.00.0510.51 4.00.10.5 6.00.010.1 (3)加DNA样品 载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待电 泳的样品相混合的一种缓冲液。 载样缓冲液有三个作用： 1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内； 2）使样品带有颜色便于简化上样过程； 3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速 率向阳极迁移。 (4)凝胶电泳的标准DNA (5)电泳条件 (6)溴化乙锭染色和紫外观察 通过染色, 紫外灯下检测。 主要有溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染色法和 SYBR Gold染色法。 EB被认为是一种强致癌物质被认为是一种强致癌物质

6、 EB可用来检测单链或双链核酸可用来检测单链或双链核酸 当要知道当要知道DNA片段准确大小片段准确大小 时，凝胶应在无时，凝胶应在无EB情况下电泳，情况下电泳， 电泳结束后再用电泳结束后再用EB染色。染色。 2000 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商 品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且 结合后，能够极大增强荧光信号。 可以用透射或入射紫外光对EB染 色的凝胶成像，图像可以直接输出到 计算机观察。 （三）聚丙烯酰胺凝胶电泳（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳 在在TEMED (四甲基乙二胺四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原产生催化过

7、硫酸铵还原产生 的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成 聚丙烯酰胺的线状长链。聚丙烯酰胺的线状长链。 在双功能交联剂如在双功能交联剂如N，N-亚甲双丙烯酰胺的参与亚甲双丙烯酰胺的参与 下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网 格结构。格结构。 网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联 剂的浓度。剂的浓度。 CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺） CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N-亚甲双丙烯酰胺） 1

8、变性聚丙烯酰胺凝胶变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链用于单链DNA片段的分离或纯化。片段的分离或纯化。 变性的变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组 成及序列完全无关。成及序列完全无关。 用途：放射性用途：放射性DNA探针的分离、探针的分离、DNA测序反应等。测序反应等。 2 非变性聚丙烯酰胺凝胶非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链用于双链DNA片段的分离和纯化。片段的分离和纯化。 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。 用途：制备高纯度的用途：制备高纯度的DNA片段。片段。 DNADNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围在聚丙烯胺凝

9、胶中的有效分离范围 丙烯酰胺浓度丙烯酰胺浓度 （%） 有效分离范围有效分离范围 （bp） 二甲苯氰二甲苯氰FF溴酚蓝溴酚蓝 3.510002000460100 5.08050026065 8.06040016045 12.0402007020 15.0251506015 20.061004512 注注:N,N-亚甲亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30; 1/30; （四）（四） 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳 pulsed-field gel electrophoresis PFGE 为何选为何选PFGE？ 超过一定大小的线状双链超过一定大小的线状双链DNA分子在

10、琼分子在琼 脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长 度（度（40kb）后）后DNA的迁移速率几乎与分子大的迁移速率几乎与分子大 小无关，而主要决定于电场强度。但小无关，而主要决定于电场强度。但 PEGE 解决了这一问题。解决了这一问题。 PFGE 工作的基本原理工作的基本原理 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进 行的。行的。DNADNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需分子在交替变换方向的电场中作出反应所需 的时间取决于它的大小。的时间取决于它的大小。 该法可分离长至该法可分离长至5Mb5Mb的的DNA

11、DNA分子。严格说来，应叫交替分子。严格说来，应叫交替 电场凝胶电泳。电场凝胶电泳。 B+ A- +A -B 脉冲电场电泳示意图脉冲电场电泳示意图 垂直脉冲场电泳系统垂直脉冲场电泳系统(vertical pulsed field) 场翻转系统场翻转系统(field inversion) 旋转胶系统旋转胶系统(rotating gel) 钳位均匀电场系统钳位均匀电场系统(contour-clamped homogeneous electric field) （五）变性凝胶电泳（五）变性凝胶电泳 RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下 进行。非变性电泳使用1.0%-1.4%的凝胶，不 同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。 只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与 分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分 子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所 抽提的总RNA样