提高先导化合物活性重现性试验

1、提高先导化合物活性重现性试验DOI：10.14088/jki.issn0439-8114.2016.23.032： In view of the instable reproducibility ofre-fermentation activities in screening of lead compounds， the effects of storage time on the reproducibility of activity in screening process were studied. Several batches of re-fermentation samples

2、were used to test against 3 insecticide targets and 4 herbicide targets. The results showed that in screening of strains in storage for 1 year ， about 60%of screening samples lost their initial activities ， but in screening of strains with half a years storage ， only about 40% of strains lost activi

3、ties. Adjusting re-fermentation intervals according to the results ， and changing the concentrated re-fermentation into a decentralized re-fermentation in synchronization，the re-fermentation in accordance with the preliminary screening concluded that about 81.56% strains could realize the preliminar

4、y screening activity ， which greatly improved the detection efficiency of alternative compounds.微生物源先导化合物源于微生物发酵代谢产物， 常规的筛选流程持续时间长达数月。 由于发酵产物的不稳定性， 微生物源先 导化合物的初筛、复筛、化合物分离、纯化和制备都需要新鲜的 发酵液， 对于每年近一百万份的高通量筛选体系， 不可能对每个 菌株预先进行大量发酵， 制备足量的发酵液用于整个流程。 近几 年的筛选结果显示，每一轮重复发酵，有近50%的提取物无法重现活性。 重现活性的提取物中， 大部分含有杀粉蝶素或

5、格尔德霉 素类的高产量、高毒性、广谱的已知化合物，低产量、低毒性的 化合物在重复发酵过程中更容易丢失。 本研究为提高活性化合物 的重现性，对 3 个杀虫活性筛选靶标和 4 个除草活性筛选靶标进 行了试验，以提高先导化合物的筛选效率。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 先导化合物 筛选靶标：狗芽根、油菜、拟南芥、浮 萍、小菜蛾、棉铃虫、蚜虫，共 7 个靶标。1.1.2 琼脂粉 北京鼎昌盛生物技术有限责任公司生产，型 号 DH010-4。1.1.3 试剂 丙酮、乙醇、二甲基亚砜（DMSO、N N-二甲 基甲酰胺（DMF、吐温-80试剂，以上试剂均为市售分析纯化 学试剂。1.1.4 供筛选试验

6、样品 放线菌、真菌发酵提取物，由湖北 省生物农药工程研究中心微生物工程研究室提供； 提取物组分及 纯化样品由湖北省生物农药工程研究中心化学分析研究室提供；供试靶标由湖北省生物农药工程研究中心养虫室提供。1.1.5 主要仪器设备 B100-1F 蠕动泵、 BIOHIT eLINE 八能 道电子移液器、 Intega96 通道移液机、 96 孔组织培养板、 24 孔 组织培养板、人工气候室。1.2 试验方法1.2.1 菌株的选择及分组 长期冷冻保藏的菌株为 2014 年212月完成初筛的菌株。选择初筛有杀虫或除草活性的菌株进 行分组， 仅对一个靶标有活性的菌株为第一组， 对两个及两个以 上靶标有活

7、性的菌株为第二组。 未经长期冷冻保藏的菌株选择范 围为 2015年6月至 2016年 2月完成初筛的菌株， 选择初筛有杀 虫或除草活性的菌株按活性进行分组， 仅对一个靶标有活性的菌 株为第三组，对两个及两个以上靶标有活性的菌株为第四组。1.2.2 菌株活化和重复发酵及提取 对“1.2.1 ”选择的 4 组菌株进行活化和重复发酵。 发酵液立即进行冻干、 提取和干燥， 每一个提取物分别用甲醇溶解后分成 3 等份，其中一份用于生物 测定，一份用于高效液相色谱分析， 一份冷冻保存。 1.2.3 重复发酵提取物的筛选及与原始发酵提取物的筛选结果比较1）提取物的生物测定。把各提取物配制成母液，浓度以发酵液

8、体积为基准，每4 mL发酵液的提取物为一个单位， 加入0.1 mL乙醇溶解，然后加入0.9 mL无菌水制成母液。以人工饲料表 面涂布法进行小菜蛾和棉铃虫的生物测定 1 ，以浸叶法进行蚜 虫的生物测定，以琼脂表面涂布法进行油菜、狗芽根、拟南芥除草活性的生物测定 2 ，以浸渍法进行浮萍除草活性的生物测定。各组织培养板中加入人工饲料或琼脂量为 0.2 mL/ 孔，表面 涂布提取物溶液量为 0.02 mL/ 孔，每个浓度设 2 个重复。培养 条件为：温度25 C,相对湿度70%-80%光照时间14 h/d 。7 d 后检查并记录结果。2）活性评价指标。根据活性反应的不同，使用两项指标标 记除草活性 3

9、 ：种子不萌芽的标记为 9，植株长势（株高）不 及空白对照的标记为 5，与空白对照相近则标记为 0；第二种以 植株黄化为指标进行标记，按 0、5Y、9Y 分级。杀虫活性分为三 级4 ，幼虫全部死亡标记为 9，幼虫部分死亡或生长缓慢标记 为 5，与空白对照相近标记为 0。3）活性结果比对 5 。比较原始提取物与重复发酵提取物的 活性吻合率。在本试验中，只要复筛活性发生变化，无论靶标增 加或减少， 都统计为复筛活性与初筛活性不吻合。 而在实际筛选 流程中，只要对任一靶标有活性，均视为重复有活性，可以进入 下一步筛选步骤。1.2.4 根据初筛结果选择有活性的菌株， 同步进行重复发酵 常规的复筛流程，

10、需要集中一批初筛有活性的样品，通常 6090 个，然后同时进行摇瓶发酵、提取、干燥、分析。每次发酵 都要进行菌种活化、二级发酵、提取、干燥、生物测定等，整个 流程时间长， 而且各环节之间有时间间隔， 重复发酵时间间隔通 常在 25 周以上。本试验根据每周初筛结果，对初筛有活性的样品，同步进行重复发酵；所用菌种为近期进行第一次发酵，菌种 只经过短期低温保存（4 C），初筛与重复发酵间隔时间为56 周。2 结果与分析2.1长期冷冻保藏（-20 C）菌株，经过重新活化、发酵、 提取后进行筛选的结果2.1.1 长期冷藏杀虫活性样品重复筛选结果 为准确地比较 复筛活性重现， 把杀草活性和杀虫活性分别进行

11、分析。 试验结果（表 1 ）显示，除了对蚜虫、小菜蛾和棉铃虫具有广谱活性的样 品外，其他活性样品复筛活性重现率均较低，平均重现率为 39.02%。2.1.2 长期冷藏除草活性样品重复筛选结果2014年 2 1 2月拟南芥尚未进行常规筛选，所以本批样品 复筛中没有拟南芥进行复筛。结果（表2）显示， 除了对油菜、浮萍和狗芽根具有广谱活性的样品外， 其他样品复筛活性重现率 均低，平均重现率为 33.92%。2.2短期低温保藏（4 C）菌株重复发酵后进行筛选的结果2.2.1 短期冷藏杀虫活性样品重复筛选结果 表 3 显示，对 蚜虫、小菜蛾和棉铃虫具有广谱活性的样品重现率达到100%，其他活性样品复筛活

12、性重现率均大于50%，平均重现率为59.85%。2.2.2 短期冷藏除草活性样品重复筛选结果 表 4?示，对拟南芥、油菜、浮萍和狗芽根具有广谱活性的样品重现率为100%，其他活性样品复筛活性重现率均高于 50%，平均重现率为 66.95%。2.3 复筛菌株进行同步发酵的结果从 2016 年 4 月开始，对初筛有活性的菌株进行重复发酵， 连续 7 周。每周进行重复发酵样品 20株左右。重复发酵和第一 次发酵时间间隔为 6 周左右。选择具有杀虫或除草活性的 182个 菌株进行重复发酵。重复发酵成功 179 株， 3 株生长不正常，复 筛重现活性的样品共 146 个，活性重现率为 81.56%。3 讨论以生物测定活性为导向的微生物源先导化合物筛选， 需要经 过初次发酵、生物测定、重复发酵和活性确认，然后进行大量发 酵，对目标化合物进行预选、分离、纯化和结构分析。获得一个 新化合物的整个筛选流程持续时间需要 40 周以上。在整个流程 中，经过几次重复发酵、提取和纯化后，其间不断有活性化合物 流失。从本研究结果可以看出， 重复发酵对活性样品的流失影响 很大，随着重复发酵间隔时间的减小，活性重现率提高；在实际 筛选中，菌种活化、二级发酵、提取、生物活性测定、高效液相 色谱分析等，每个步