南农生物技术制药基因工程药物

1、 Genentech 公司公司 1976年，年，27岁的风险投资人岁的风险投资人Robert Swanson与与University of California的教授的教授 Herb Boyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因共饮了几杯啤酒，讨论了基因 工程技术的商业前景。讨论结束时，他们工程技术的商业前景。讨论结束时，他们 决定建立一个公司，并取名为决定建立一个公司，并取名为Genentech （Genetic Engineering Technology）。）。 第一个基因工程公司在学术界和商业界第一个基因工程公司在学术界和商业界 的满腹怀疑中诞生了！的满腹怀疑中诞生了！ Genentech的骄

2、人业绩的骄人业绩 1976Genentech创立创立 1977首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素 1978克隆了人胰岛素基因克隆了人胰岛素基因 1979克隆了人生长激素素基因克隆了人生长激素素基因 1980公司上市，募集公司上市，募集$ 35million 1982第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给Lilly公司）公司） 1984第一个第一个VIII因子，转让给因子，转让给Cutter Biological 1985第一个自己生产的产品（人生长激素）第一个自己生产的产品（人生长激素） 1987生产组织纤

3、溶酶原激活剂（生产组织纤溶酶原激活剂（tPA） 1990生产生产interferon 1 1990与瑞士与瑞士Roche医药公司合并（医药公司合并（$ 2.1billion） 美国已批准上市的基因工程药物（美国已批准上市的基因工程药物（1997.7） 1 中国已经批准上市的基因工程药物（中国已经批准上市的基因工程药物（1998.5） 一、基因工程与医药卫生一、基因工程与医药卫生 1、生产基因工程药品 （1 1）传统的某些药品（如动物激素）生产：）传统的某些药品（如动物激素）生产： 控制某种物控制某种物 质合成基因质合成基因 转基因转基因 “工程菌工程菌” 基因工基因工 程药品程药品 基因表基因

4、表 达产物达产物 基因工程基因工程发酵分离提取 从动物组织中提取，生产量小，价格昂贵。 （3 3）基因工程生产的药品）基因工程生产的药品 重组人生长激素 重组人白细胞介素 重组人干扰素 重组人胰岛素 发酵罐 （2 2）基因工程方法生产药品的方法：）基因工程方法生产药品的方法： 12 二、基因工程菌大肠杆菌表达系统二、基因工程菌大肠杆菌表达系统 一：大肠杆菌表达外源基因的优势一：大肠杆菌表达外源基因的优势 二二 大肠杆菌表达载体的基本组成大肠杆菌表达载体的基本组成 三三 常用的大肠杆菌表达载体常用的大肠杆菌表达载体 四四 真核基因在大肠杆菌中的表达真核基因在大肠杆菌中的表达 五五 大肠杆菌表达真

5、核基因存在的问题大肠杆菌表达真核基因存在的问题 六六 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 七七. 人胰岛素的生产方法人胰岛素的生产方法 一：大肠杆菌表达外源基因的优势一：大肠杆菌表达外源基因的优势 l全基因组测序全基因组测序 , 共有共有4405个开放型阅读框架个开放型阅读框架 l基因克隆表达系统成熟基因克隆表达系统成熟 l繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 l被美国被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物 大肠杆菌表达外源基因的劣势大肠杆菌表达外源基因的劣势 l缺乏对真核生物蛋白质的复性功

6、能缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 l缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 l内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 l细胞周质内含有种类繁多的内毒素细胞周质内含有种类繁多的内毒素(endotoxin) periplasm heterogous 二二 大肠杆菌表达载体的基本组成大肠杆菌表达载体的基本组成 一个良好的大肠杆菌表达载体：一个良好的大肠杆菌表达载体： l有抗菌素抗性基因有抗菌素抗性基因 l决定载体拷贝数的复制起点决定载体拷贝数的复制起点 (ori ) l供外源基因插入的多克隆位点。供外源基因插入的多克隆位点。 l

7、参与控制转录与翻译的必不可少的原件参与控制转录与翻译的必不可少的原件 外源基因在原核寄主细胞中表达外源基因在原核寄主细胞中表达 , 它的编码结构它的编码结构 必须是连续的必须是连续的 , 不间断的不间断的 , 处于寄主启动子有效处于寄主启动子有效 控制下。控制下。 1启动子启动子 可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个 条件条件 1 ) 强启动子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的强启动子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的 10 % - 30 %以上以上 2 ) 应能呈现出一种低限的基础转录水平应能呈现出一种低限的基础转录

8、水平 3 ) 应该是诱导型的应该是诱导型的 , 能通过简单的方式能通过简单的方式,使用廉价的诱导物使用廉价的诱导物 得以诱导。得以诱导。 Account for inducible b: 如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止 子子 , , 那么由该启动子驱动的克隆基因的转录便会被那么由该启动子驱动的克隆基因的转录便会被 限制在最低本底水平。限制在最低本底水平。 2 终止子终止子 a : 如果在克隆基因编码区的如果在克隆基因编码区的3 末端之后，接上一个有效的转录终止子，末端之后，接上一个有效的转录终止子， 便能够阻止转录通读过位于下游另一个启

9、动子便能够阻止转录通读过位于下游另一个启动子 c: 转录终止子还能增强转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性分子的稳定性, 大大提高蛋白质产物水平。大大提高蛋白质产物水平。 在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码 子子 , 阻止核糖体跳跃阻止核糖体跳跃 (skipping )现象。现象。 大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子UAA, 当其后连上一个当其后连上一个U而形成而形成 四联核苷酸的情况下四联核苷酸的情况下 , 转译终止效率便会得到进一步加强。转译终止效率便会得到进一步加强。 3转译起始序列转译起始序列 m

10、RNA的的5 末端之独特的结构特征末端之独特的结构特征 , 是决定是决定mRNA转译起始效率的主转译起始效率的主 要因素。要因素。 在构建外源基因的高效表达载体时在构建外源基因的高效表达载体时 , 需认真选择有效的转录起始序列。需认真选择有效的转录起始序列。 未鉴定出未鉴定出通用通用有效的转译起始序列的有效的转译起始序列的保守结构保守结构 initiation factor conserved sequence universial 4、reporter gene 其编码产物可被快速测定的功能单元。其编码产物可被快速测定的功能单元。 l 追踪某些特定的追踪某些特定的DNA结构结构 (重组质粒重

11、组质粒 )是否已经导入是否已经导入 寄主细胞寄主细胞 l 同任何一种目的启动子连接同任何一种目的启动子连接 , 其表达活性可作为检其表达活性可作为检 测启动子功能的依据。测启动子功能的依据。 usage 半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ 、 碱性磷酸酶基因、碱性磷酸酶基因、 荧光素酶基因荧光素酶基因 (luciferase )基因、基因、 半乳糖激酶基因半乳糖激酶基因(galK ) 氯霉素抗性氯霉素抗性(乙酰转移酶乙酰转移酶)基因基因 (cat ) 四环素抗性基因四环素抗性基因 (tetr ) alkaline phosphatase 三三 常用的大肠杆菌表达载体启动子常用的大肠杆菌表达载

12、体启动子 广泛使用的大多数质粒表达载体启动子广泛使用的大多数质粒表达载体启动子 l 噬菌体的噬菌体的PL启动子启动子 l 大肠杆菌乳糖操纵子大肠杆菌乳糖操纵子lac启动子启动子 l 色氨酸操纵子色氨酸操纵子trp启动子启动子 l pBR322质粒的质粒的beta内酰胺酶启动子内酰胺酶启动子 Lactose Operon 图1-1 在大肠杆菌中基因表达的3个重要信号 启动子 核糖体结合位点 基因 终止子 DNA RNA转录 核糖体结合mRNA位点 图图1-2 基因转录起始位点上游序列的比较基因转录起始位点上游序列的比较 TTGACATATAAT Pu Py -35区区 -30 -70 正调控区正

13、调控区 -20 负调控区负调控区 +1 -10区区 GC区区.CAAT区区 TATAAA T PuAPy -40-110+1-20-30 增强子增强子 CCGCCC或或GGGCGG或或GGCCAATCT T A 原核原核 真核真核 图1-3 通过表达载体在大肠杆菌中被 表达 P R T T P R T P R mRNA 蛋白质 表达载体 外源基因 将外源基因插入 限制性酶切位点 转化大肠杆菌 图1-4 杂交基因的构建和融合蛋白的 合成 P R T P R T 插入外源基因 ATA TTA 正确融合 N端 C端 不正确融合 外源基因不被翻译 表达 ATA TTA GGA GCT GGA GC 融

14、合蛋白亲和层析法纯化 化学试剂除去大肠杆菌肽段 图1-5 在大肠杆菌中表达外源基因长遇到的问题 翻译 转录 P R T T 转录 大肠杆菌不能切 除内含子 转录提前 终止 图1-6 真核细胞表达载体常用的4种启动子 P 半乳糖 转录 GAL10 P 甲醇 转录 乙醇氧化 酶基因 （a）GAL启动子 （b）AOX启动子 （c）葡萄糖水解酶启动子 （d）纤维二糖水解酶启动子 P 纤维素 转录 纤维素二糖 水解酶基因 P 淀粉 转录 葡萄糖淀 粉酶基因 木糖 不转录 四四 真核基因在大肠杆菌中的表达真核基因在大肠杆菌中的表达 三种表达部位各有不同的优缺三种表达部位各有不同的优缺 点点 / 而且对克隆

15、基因表达产物而且对克隆基因表达产物 的制备有很大关系。的制备有很大关系。 l 在细胞质中表达在细胞质中表达 l 在细胞周质中表达在细胞周质中表达 l 以分泌到细胞外的形式表达。以分泌到细胞外的形式表达。 1 1 外源基因在大肠杆菌中表达蛋白质位置外源基因在大肠杆菌中表达蛋白质位置 cytoplasm periplasm 1 ) 细胞质中表达细胞质中表达 expressed in cytoplasm 包含体是存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶包含体是存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶 体结构。体结构。 在表达中应尽可能限制包含体产生在表达中应尽可能限制包含体产

16、生, 并促进形成天然三维结构的蛋白并促进形成天然三维结构的蛋白 质。质。 多采用与分子伴侣共表达的方法多采用与分子伴侣共表达的方法, 可能是增加外源蛋白的可溶性和折可能是增加外源蛋白的可溶性和折 叠能力的一种有效途径。叠能力的一种有效途径。 insoluble chaperon 周质周质 : 指大肠杆菌一类指大肠杆菌一类G-菌中，位于内膜和外膜之间的细菌中，位于内膜和外膜之间的细 胞结构部分。胞结构部分。 在大肠杆菌中在大肠杆菌中 , 已成功的使用了各种不同类型信号肽已成功的使用了各种不同类型信号肽 , 将细胞质中蛋白的蛋白质转运至周质。将细胞质中蛋白的蛋白质转运至周质。 周质中表达外源蛋白质

17、优点周质中表达外源蛋白质优点: A : 周质中蛋白质种类少周质中蛋白质种类少 , 周质中表达的外源蛋白质能够被有效的周质中表达的外源蛋白质能够被有效的 浓缩和纯化。浓缩和纯化。 b: 周质氧化环境有利于蛋白质按正确的方式折叠周质氧化环境有利于蛋白质按正确的方式折叠 c: 在周质中蛋白质降解不广泛。在周质中蛋白质降解不广泛。 来自原核、真核的外源基因都成功的在大肠杆菌细胞周质中实现了有来自原核、真核的外源基因都成功的在大肠杆菌细胞周质中实现了有 效表达。效表达。 2 ) 周质中表达周质中表达 expressed in periplasm 3) 分泌表达分泌表达 使在大肠杆菌中表达的外源蛋白质分泌

18、到胞使在大肠杆菌中表达的外源蛋白质分泌到胞 外培养基中进行分离纯化外培养基中进行分离纯化 , 这种研究思路称为这种研究思路称为 外源蛋白质的分泌表达。外源蛋白质的分泌表达。 l目的蛋白稳定性高目的蛋白稳定性高: l目的蛋白易于分离目的蛋白易于分离 l目的蛋白末端完整目的蛋白末端完整 将外源基因与大肠杆将外源基因与大肠杆 菌信号肽编码序列重菌信号肽编码序列重 组在一起进行分泌表组在一起进行分泌表 达达 , 其其N端的甲硫氨端的甲硫氨 酸残基可在信号肽剪酸残基可在信号肽剪 切过程中被有效除去切过程中被有效除去 这些真核基因在大肠杆菌中表达这些真核基因在大肠杆菌中表达 时时 , 蛋白质甲硫氨酸残基往

19、往不蛋白质甲硫氨酸残基往往不 能被切除。能被切除。 分泌表达优点分泌表达优点 : 重组人胰岛素原若分泌到细胞重组人胰岛素原若分泌到细胞 周质中周质中 , 其稳定性大约是在细胞其稳定性大约是在细胞 质中的质中的10倍倍 许多真核生物成熟蛋白许多真核生物成熟蛋白N端不含有端不含有 甲硫氨酸残基。甲硫氨酸残基。 intact excise 外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进 行分泌型表达行分泌型表达; 外源基因分泌表达的表达率通常要比包外源基因分泌表达的表达率通常要比包 涵体形式低很多涵体形式低很多 分泌表达缺点分泌表达缺点 相对其它生物细胞相对其它生物细胞 , 大

20、肠杆菌蛋白分泌机制不健全。大肠杆菌蛋白分泌机制不健全。 目前产业化的异源蛋白分泌型重组目前产业化的异源蛋白分泌型重组 大肠杆菌工程菌很少大肠杆菌工程菌很少 Perfect sound l分泌型重组蛋白具有较高比例分泌型重组蛋白具有较高比例 正确构象，正确构象， l对蛋白酶不敏感对蛋白酶不敏感 蛋白质的分泌机制蛋白质的分泌机制 原核细胞周质中有多种分子伴侣原核细胞周质中有多种分子伴侣 , 可阻止分泌蛋白随机折叠可阻止分泌蛋白随机折叠 l分泌至细胞周质或培养基中分泌至细胞周质或培养基中 l重组蛋白很少形成分子间二硫键重组蛋白很少形成分子间二硫键 与包涵体相比与包涵体相比 random Sulfer

21、 inner outer 重组大肠杆菌重组大肠杆菌 -目的蛋白完全分泌目的蛋白完全分泌 分泌型目的蛋白表达系统构建分泌型目的蛋白表达系统构建 有些有些G- 能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中 , 这一过程严这一过程严 格依赖于格依赖于细菌素释放蛋白细菌素释放蛋白 , 它激活定位于内膜上的磷酸酯酶它激活定位于内膜上的磷酸酯酶 , 导致细菌导致细菌 内外膜的通透性增大。内外膜的通透性增大。 将细菌素释放蛋白编码基因克隆将细菌素释放蛋白编码基因克隆 在一个合适的质粒上在一个合适的质粒上 携带大肠杆菌信号肽编码序列和携带大肠杆菌信号肽编码序列和 目的基

22、因的表达质粒目的基因的表达质粒 转化转化 受体细胞受体细胞 完全分泌型受体细胞完全分泌型受体细胞 转化转化 permeability bacteriocin 二种类型二种类型 l由报告基因编码序列和另一个基因启动子及其它的调节由报告基因编码序列和另一个基因启动子及其它的调节 序列构成。用于研究启动子功能及调控作用分子机理。序列构成。用于研究启动子功能及调控作用分子机理。 l由一种异源蛋白质基因编码序列同寄主细胞诱导型启动由一种异源蛋白质基因编码序列同寄主细胞诱导型启动 子构成。用于生产新型融和蛋白。子构成。用于生产新型融和蛋白。 2 融和蛋白质表达融和蛋白质表达 将外源基因与受体菌自身的蛋白质

23、编码基因拼接在一起将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起 , 并作为一个并作为一个 开放型阅读框架进行表达。这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋开放型阅读框架进行表达。这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋 白。白。 2.1 融和基因融和基因 attention 外源基因应装在受体蛋白编码基因下游外源基因应装在受体蛋白编码基因下游 , 为融合蛋白提供终止密码子。在为融合蛋白提供终止密码子。在 某些情况下某些情况下 , 并不需要完整的受体结构基因并不需要完整的受体结构基因 2.2 融和蛋白的表达策略融和蛋白的表达策略 融合蛋白表达质粒的构建原则融合蛋白表达质粒的构建原则 受体细胞的结构基

24、因能高效表达受体细胞的结构基因能高效表达 , 且其表达产物可以且其表达产物可以 通过亲和层析进行特异性简单纯化通过亲和层析进行特异性简单纯化 两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要 , 它直接决定融合蛋白的裂它直接决定融合蛋白的裂 解。解。 两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架 在在DNA水平上，人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试水平上，人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试 剂特异性断裂位点剂特异性断裂位点 , 可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释 放回收异源蛋白放回收异源蛋

25、白 Base on consistent l使克隆外源基因有效转译使克隆外源基因有效转译 有效转译：取决于核糖体的结合位点有效转译：取决于核糖体的结合位点 , 受到编码区起点核苷酸序列影响。受到编码区起点核苷酸序列影响。 l可使蛋白质产物稳定可使蛋白质产物稳定 , 免受寄主胞内酶的降解作用免受寄主胞内酶的降解作用 , 因此可以得到较高的产率。因此可以得到较高的产率。 l可能构成一种信号肽指导大肠杆菌蛋白质分配到细胞可能构成一种信号肽指导大肠杆菌蛋白质分配到细胞 的正确位置。的正确位置。 l能够使用亲和层析技术分离纯化融合蛋白。能够使用亲和层析技术分离纯化融合蛋白。 2.3 表达融合蛋白质的优点

26、表达融合蛋白质的优点 ribosome 3 3 整合型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达 l工程菌在没有选择压力存在下工程菌在没有选择压力存在下 ,可以连可以连 续培养而不丢失目的基因表达盒续培养而不丢失目的基因表达盒, 这对以这对以 改良物种遗传性状为目的的基因工程特改良物种遗传性状为目的的基因工程特 别有意义别有意义 3.1 3.1 整合形式表达目的蛋白的特点整合形式表达目的蛋白的特点 u目的基因稳定表达目的基因稳定表达 u目的基因表达率低目的基因表达率低 l整合型的目的基因随受整合型的目的基因随受 体细胞染色体体细胞染色体DNADNA一起复制一起复制, 在大多数情况下相当稳定在大多数情况

27、下相当稳定 单拷贝整合的目的基因表达率受到限制单拷贝整合的目的基因表达率受到限制 , 此时可通过强化表达元件加以此时可通过强化表达元件加以 补偿补偿 replicate/ stabilitySpecies/ improvement intensify 转位因子依赖型的体内重组转位因子依赖型的体内重组 同源序列依赖型的体内重组同源序列依赖型的体内重组 3.2 DNA体内重组的基本原理体内重组的基本原理 生物细胞内天然存在的一类无复制能力的生物细胞内天然存在的一类无复制能力的DNA可移动因子可移动因子 , 不同生物种群拥有结构不同的转位因子不同生物种群拥有结构不同的转位因子 噬菌体噬菌体 G片段片

28、段 (G-Fragment ) 原核微生物原核微生物 插入顺序插入顺序 (IS ) 真核微生物真核微生物 转座子转座子 (Tn、Ty ) 高等植物高等植物 可移动因子可移动因子 (Ac、Ds ) 高等动物高等动物 跳跃基因跳跃基因 (mobile gene ) 转位因子转位因子 transposon 转位因子依赖型的体内重组转位因子依赖型的体内重组 转位因子的结构转位因子的结构 transposon palindrome repressor inversion region 整合形式整合形式 同源整合同源整合 同源序列依赖型的体内重组同源序列依赖型的体内重组 同源整合同源整合 一般地说一般地说

29、 , 距离越远、长度越长、同源性越高距离越远、长度越长、同源性越高 , 重组的频率也就越高重组的频率也就越高 , 反之亦然。反之亦然。 同源整合同源整合 1基因结构存在很大差异。大多数真核基因含有内含子，细菌基因结构存在很大差异。大多数真核基因含有内含子，细菌 细胞中没有除去内含子机制；细胞中没有除去内含子机制； 五五 大肠杆菌表达真核基因存在的问题大肠杆菌表达真核基因存在的问题 2 转录信号不同。真核基因转录的转录信号不同。真核基因转录的mRNA分子不具有结合细菌核糖体所必分子不具有结合细菌核糖体所必 须的须的SD序列。细菌序列。细菌RNA聚合酶不能识别真核生物启动子聚合酶不能识别真核生物启

30、动子 3 mRNA的分子结构有所差异。绝大多数真核的分子结构有所差异。绝大多数真核mRNA分子的分子的3 末端有末端有 poly(A)尾巴尾巴 ，在，在5 末端有一个帽结构。影响末端有一个帽结构。影响mRNA在细菌中的稳定性在细菌中的稳定性 及与细菌核糖体相结合的能力，及与细菌核糖体相结合的能力， 阻止正常的转录和转译。阻止正常的转录和转译。 4真核生物的蛋白质真核生物的蛋白质 -有些是通过前体分子加工来的。有些是通过前体分子加工来的。 在细菌中不存在这种修饰作用。在细菌中不存在这种修饰作用。 5细菌的蛋白酶细菌的蛋白酶 -可以识别和降解真核生物的蛋白质产物可以识别和降解真核生物的蛋白质产物

31、l结构不稳定性结构不稳定性 重组重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰分子上某一区域发生缺失、重排、修饰 ，导致其表观生物学，导致其表观生物学 功能的丧失功能的丧失 六六 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 1 工程菌遗传不稳定性表现形式工程菌遗传不稳定性表现形式 基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳性基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳性 , 具有下列两种具有下列两种 表现形式表现形式 l分配不稳定性分配不稳定性 整个重组整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸分子从受体细胞中逃逸 segregative instability do

32、main Deletion region rearrange l受体细胞中的限制修饰系统对外源重组受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解分子的降解 2 工程菌遗传不稳定性的产生机制工程菌遗传不稳定性的产生机制 l外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢 能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反 应应 ， 关闭合成途径关闭合成途径 ，启动降解，启动降解 l重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 是重组质粒逃逸的基

33、本原因是重组质粒逃逸的基本原因 l受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排 Deletion l以构建稳定性高质粒以构建稳定性高质粒: 将将R1质粒上的质粒上的parB基因引入表达型载体中基因引入表达型载体中: 其表达产物可以选择性其表达产物可以选择性 地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 3 改进载体、受体系统改进载体、受体系统 l正确设置载体上的多克隆位点正确设置载体上的多克隆位点: 禁止禁止DNA片段插在稳定区内片段插在稳定区内 l将受体细胞的致死性基因安装在载体上，并构建条件致将受体细胞的致

34、死性基因安装在载体上，并构建条件致 死性的相应受体系统死性的相应受体系统 。 eg:大肠杆菌的大肠杆菌的ssb基因基因 (DNA单链结合蛋白编码基因单链结合蛋白编码基因) 根据载体上的抗药性标记根据载体上的抗药性标记 , 向培养系统中添加相应的抗生素向培养系统中添加相应的抗生素 (药物和食品生产时禁止使用抗生素药物和食品生产时禁止使用抗生素) 4 施加选择压力施加选择压力 根据载体上的营养缺陷型标记根据载体上的营养缺陷型标记 , 向培养系统中添加相应的向培养系统中添加相应的 营养组份营养组份(培养基复杂培养基复杂 , 成本较高成本较高) correspond l使用可控型启动子控制目的基因定时

35、表达及表达程度使用可控型启动子控制目的基因定时表达及表达程度 5 控制目的基因过量表达控制目的基因过量表达 l使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数 (优化基因工程菌的培养工艺优化基因工程菌的培养工艺) l培养基组成培养基组成 : 限制培养基比丰富培养基更有利于稳定限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 l培养温度培养温度 : 较低培养温度有利于重组质粒的稳定较低培养温度有利于重组质粒的稳定 replicon 1982年年 , 美国美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素 , 成为

36、世成为世 界上第一个上市的基因工程药物。界上第一个上市的基因工程药物。1987年年 , Novo公司公司 , 成为世界上第一成为世界上第一 个上市的基因工程药物。个上市的基因工程药物。1987年年 , Novo公司又推出了利用重组酵母菌生公司又推出了利用重组酵母菌生 产人胰岛素的新工艺。产人胰岛素的新工艺。 七七. 人胰岛素的生产方法人胰岛素的生产方法 基因工程法生产人胰岛素基因工程法生产人胰岛素 l体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖 作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别作用、血浆药代动

37、力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别 l具有无免疫原性、注射吸收迅速。充分展示了基因工程在生物医药领域具有无免疫原性、注射吸收迅速。充分展示了基因工程在生物医药领域 中的巨大潜力。中的巨大潜力。 potential immunogenic SHSH SHSH C C C C COO_ SHSH N C C S.S. Pre-pro-insulin SS SS C C C C COO_ SS C C S-S Pro-insulin N SS SS C C C C COO_ C C S S S-S insulin N 基因工程菌的构建战略：化学合成A链和B链的编码序列 表达重组人胰岛素的大肠杆菌

38、工程菌的构建 A链和B链分别表达法 1 synthesis 由于由于A链和链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确 配对率较低配对率较低 , 通常只有通常只有10% - 20%. 采用这条工艺路线生产正确配对率较低采用这条工艺路线生产正确配对率较低 , 采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以美元以 上。上。 A链和链和B链分别表达法链分别表达法生产技术评价生产技术评价 为了进一步降低生产成本为了进一步降低生产成本 , 美国美国Ely LiLi公司随后又建立了第二公司随后又建立

39、了第二 条生产重组人胰岛素的工艺路线条生产重组人胰岛素的工艺路线 基因工程菌的构建战略基因工程菌的构建战略 人胰岛素原表达法人胰岛素原表达法proinsulin 表达产物后处理路线 B链中第22位上的Arg和第29 位上的Lys , 由于良好折叠的 原因 , 对胰蛋白酶不敏感 在人胰岛素原表达工艺中在人胰岛素原表达工艺中 , 由于由于C肽的存在肽的存在 , 胰岛素原能形成良好的空间构象胰岛素原能形成良好的空间构象 , 三对二硫键的正确配对率也相应提高三对二硫键的正确配对率也相应提高 , 折叠率高达折叠率高达80%以上。以上。 生产技术的评价生产技术的评价 目前美国目前美国Ely LiLi公司采

40、用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。 虽然这条工艺路线不比虽然这条工艺路线不比AB链分别表达法更为简捷链分别表达法更为简捷 , 而且还要使用两种高纯而且还要使用两种高纯 度的酶制剂度的酶制剂 , 但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷 , 使得每使得每 克最终产品的成本仅克最终产品的成本仅50美元。美元。 一一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛 素原编码序列与素原编码序列与beta-內酰胺酶基因拼接內酰胺酶基因拼接 , beta-內酰

41、胺酶通常能被內酰胺酶通常能被 大肠杆菌分泌到胞外。大肠杆菌分泌到胞外。 获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优 良特性良特性 , 为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。 分泌型重组人胰岛素表达法分泌型重组人胰岛素表达法 上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序 列与大肠杆菌列与大肠杆菌beta -半乳糖苷酶基因拼接的方法半乳糖苷酶基因拼接的方法 , 所产生的融合型所产生的融合型 重组蛋白表达率高、稳定性强重组蛋白

42、表达率高、稳定性强 , 但不能分泌但不能分泌 , 只要以包涵体的形式只要以包涵体的形式 存在于胞质中。存在于胞质中。 蛋白质工程和基因工程蛋白质类药物蛋白质工程和基因工程蛋白质类药物 1、蛋白质工程的理论设计：蛋白质工程的理论设计： 包括活性设计、专一性设计、框架（构象）设计等。包括活性设计、专一性设计、框架（构象）设计等。 由于对蛋白质的结构与功能之间的关系认识还不系统，由于对蛋白质的结构与功能之间的关系认识还不系统， 目前的蛋白质设计仅仅是对天然蛋白质的修饰。目前的蛋白质设计仅仅是对天然蛋白质的修饰。 如：异常血红蛋白的氨基酸取代如：异常血红蛋白的氨基酸取代 去羧基端胰岛素等。去羧基端胰岛

43、素等。 蛋白质工程的一般技术蛋白质工程的一般技术 u根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质； u确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系； u从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合 成具有特定生物功能的全新蛋白质。成具有特定生物功能的全新蛋白质。 2、基因修饰、基因修饰点突变法点突变法 蛋白质结构的改变通过基因修饰来完成蛋白质结构的改变通过基因修饰来完成 基因修饰的方法：基因修饰的方法： 基因的全化学合成基因的全化学

44、合成 按照所需蛋白质的氨基酸顺序，先后合成结构基因、转按照所需蛋白质的氨基酸顺序，先后合成结构基因、转 录的起始信号及终止信号、限制酶切位点等核酸片段，然录的起始信号及终止信号、限制酶切位点等核酸片段，然 后用连接酶将各片段连接起来，通过基因工程转移到细菌后用连接酶将各片段连接起来，通过基因工程转移到细菌 中进行目标蛋白质的表达。中进行目标蛋白质的表达。 目前用此法已合成了：人血细胞干扰素、胰岛素、生长目前用此法已合成了：人血细胞干扰素、胰岛素、生长 激素释放抑制激素等基因。激素释放抑制激素等基因。 调节基因 启动基因 结构基因 终止基因 连接酶连接酶 完整基因 基因直接修饰法基因直接修饰法

45、将连接于质粒上的某一蛋白质的基因用酶法去除一小段，将连接于质粒上的某一蛋白质的基因用酶法去除一小段， 然后用合成的核苷酸片段接上，从而获得新的突变体。然后用合成的核苷酸片段接上，从而获得新的突变体。 已修饰过的酶有：已修饰过的酶有： 内酰胺酶、酪氨酰内酰胺酶、酪氨酰tRNA合成酶、二氢叶酸还原酶等酶蛋白。合成酶、二氢叶酸还原酶等酶蛋白。 限制性内切酶限制性内切酶 外源外源DNA 限制性内切酶限制性内切酶 退火退火 重组质粒重组质粒 转化转化 受体细胞受体细胞 筛选筛选 表达表达 带重组体的细胞带重组体的细胞 目的产物目的产物 质粒质粒 目的基因目的基因 酶切割 蛋白基因蛋白基因 核苷酸片段核苷

46、酸片段 新突变质粒新突变质粒 盒式突变盒式突变 1985年年Wells提出的一种基因修饰技术，一次可以在一提出的一种基因修饰技术，一次可以在一 个位点上产生个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分 子中重要氨基酸进行子中重要氨基酸进行“饱和性饱和性”分析。分析。 蛋白质工程的运用 酶切割 蛋白基因蛋白基因 核苷酸片段核苷酸片段 新突变质粒新突变质粒 同时获得多个突变体同时获得多个突变体 图3-1胰岛素的分子结构和从前胰岛素原合成胰岛素的简要过程 30个氨基酸 B链 21个氨基酸 A链 胰岛素利于 重组生产的 特点 前导序列 B CA 前胰岛素原（

47、胰岛素原=BCA无前导序列） 胰岛素 S S S S B A 剪切 -S-S- -S-S- L B A C 自发折叠 蛋白质工程的应用 图3-2 由人工合成的A,B链的基因合成重组胰岛素 lac启动子 lacZ A基因 运载人工合成的A基因的 载体 B基因 运载人工合成的B基因的 载体 (a)人工合成的基因 (b)合成胰岛素蛋白 A B met -半乳糖苷酶片段 A链 胰岛素 纯化A链和B链 二硫键连接 met B链 溴化氰 处理 pBR322pBR322 转化的大肠杆菌合成AB融合蛋白 图3-3重组促生长素抑制素的合成 lac启动子 lacZ 人工促生长素抑制素基因 met -半乳糖苷酶片段

48、 促生长素抑制素 融合蛋白 转化大肠杆菌 促生长素抑制素（14氨基酸） 溴化氰 图3-4重组生长素的合成 密码子 0191 19124 240 24 Hae 保留 除去 （a）生长素cDNA片段的准备过程 （b）表达 024 合成前导序列 191 cDNA lac启动子 插入表达载体 合成生长素 转化大肠杆菌 图3-5 凝血因子基因及其翻译产物 外显子（26）内含子（25） （a）凝血因子基因 （b）凝血因子的翻译后的加工 初级翻译产物 （2351个氨基酸） A BC A C 成熟的凝血因子蛋白 加工 重组凝血因子合成的几种方法 在哺乳动物细胞中合成（仓鼠细胞） 利用活体动物生产（猪） 利用表

49、达载体 Ag启动子 SV40聚腺甘酸化序列 凝血因子的cDNA 导入仓鼠细胞 重组蛋白 干扰素的合成 图3-7 利用分离的病毒壳体蛋白作疫苗的原理 分离的病毒壳体蛋白 壳体蛋白的 特异抗体 注射到血液循环 抗体包围整个病毒 被完整病毒感染 图3-8 重组牛痘病毒可能用途的基本原理 乙型肝炎表面抗原基因 牛痘病毒启动子 重组牛痘病毒基因组 牛痘病毒 乙型肝炎病毒 抗乙型肝炎抗体 抗牛痘病毒抗体 注射重组牛痘病毒 颗粒到血液循环 免疫系统合成抗牛痘病毒 和乙型肝炎病毒的抗体 表3-2 在重组牛痘病毒中表达的外源基因 BACKBACK 79 （ inclusion bodies IBs) 基因工程包

50、含体的纯化基因工程包含体的纯化 基因工程菌培养液不同表达形式的前处理基因工程菌培养液不同表达形式的前处理 (胞外分泌型表达：离心胞外分泌型表达：离心, ,收集液相收集液相浓缩浓缩纯化。纯化。 (胞内表达：胞内表达： l胞内可溶性表达：离心胞内可溶性表达：离心, ,收集菌体收集菌体细胞破碎细胞破碎离心，离心， 收集上清收集上清纯化纯化 l胞内周质表达：离心胞内周质表达：离心, ,收集菌体收集菌体低浓度溶菌酶或渗透低浓度溶菌酶或渗透 压冲击等溶解目标物压冲击等溶解目标物离心离心, ,收集上清液收集上清液纯化。纯化。 l不溶性包涵体：离心不溶性包涵体：离心, ,收集菌体收集菌体细胞破碎细胞破碎离心离

51、心, ,收集收集 沉淀沉淀包涵体洗涤包涵体洗涤目标蛋白变性溶解目标蛋白变性溶解复性复性纯化。纯化。 80 蛋白蛋白 产物占菌体总蛋白产物占菌体总蛋白 外源蛋白的积累外源蛋白的积累 人胰岛素人胰岛素50%50%形成包涵体形成包涵体 - -丙酰胺酶丙酰胺酶 20%20%在细胞间区在细胞间区 - -人体干扰素人体干扰素 25%25%形成包涵体形成包涵体 凝乳酶原凝乳酶原形成包涵体形成包涵体 牛生长激素牛生长激素30%30%形成包涵体形成包涵体 - -内酰胺酶内酰胺酶 形成间区包涵体形成间区包涵体 人胰岛素原人胰岛素原5%26%5%26%形成包涵体形成包涵体 81 Z 包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，

52、包括目标蛋白、菌体蛋白等。包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。 目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生 物活性。物活性。 Z 包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常 代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。 Z 高表达产生的积聚物在细胞内部形高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因？成不溶物原因？ 蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；蛋白过量积聚，超过溶

53、解度，导致沉淀； 蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀； 蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀； 表达蛋白过多，与其结合表达蛋白过多，与其结合/ /诱导组分不足，不能形成溶解状态诱导组分不足，不能形成溶解状态 蛋白质自身不稳定。蛋白质自身不稳定。 包含体的构成包含体的构成 82 收集菌体细胞收集菌体细胞 细胞破碎细胞破碎 包涵体的洗涤包涵体的洗涤 目标蛋白的变性溶解目标蛋白的变性溶解 目标蛋白的复性目标蛋白的复性 包含体的出现不仅增加了包含体的出现不仅增加了 生物分离设计的难度，

54、也生物分离设计的难度，也 为蛋白质折叠机理研究提为蛋白质折叠机理研究提 出了新的课题。出了新的课题。 欲获得天然活性态的目标欲获得天然活性态的目标 产物，必需分离包含体后，产物，必需分离包含体后， 溶解包含体并使其中的目溶解包含体并使其中的目 标蛋白恢复应有的天然活标蛋白恢复应有的天然活 性。性。 83 1）包涵体的洗涤）包涵体的洗涤 l细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。 l洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外， 还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖 等，复性时会与目标蛋白一

55、起复性形成杂交分等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分 子而聚集，给后步纯化带来困难。子而聚集，给后步纯化带来困难。 l洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的 弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除 去部分膜蛋白和脂质类杂质。去部分膜蛋白和脂质类杂质。 l洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达 产物为原则。产物为原则。 84 2）目标蛋白的变性溶解）目标蛋白的变性溶解 包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能 进一步

56、纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋 白质变性才能使其形成可溶性的形式。白质变性才能使其形成可溶性的形式。 常用变性剂：常用变性剂： 5-8 mol/L盐酸胍和盐酸胍和6-8 mol/L尿素尿素, 作用：破坏离子间相互作用；作用：破坏离子间相互作用； 表面活性剂如表面活性剂如1-2 SDS， 作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。 PH9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少。的碱溶液和有机溶剂，使用较少。 影响变性因素：时间、影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和、离子强度、变性剂种类和 浓度。浓度。

57、 85 原理：原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性 状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构 和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后， 蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该 过程称复性。过程称复性。 复性方法：复性方法： l稀释法除变性剂稀释法除变性剂 加入大量水或缓冲液。加入大量水或缓冲液。 l膜分离法除变性剂膜分离法除变性剂 透析、超滤、电渗析。透析、超滤、电渗析。 l层析法：凝胶层析，层析法：凝胶层析，高效疏水层析高效疏水层析

58、3） 目标蛋白的复性目标蛋白的复性 86 蛋白质复性影响因素：蛋白质复性影响因素： u变性剂浓度变性剂浓度 u目标蛋白浓度；目标蛋白浓度； upH和离子强度；和离子强度； u氧化还原条件。氧化还原条件。 还原剂：还原剂： 二硫苏糖醇、二硫苏糖醇、-巯基乙巯基乙 醇、还原型谷胱甘肽；醇、还原型谷胱甘肽； 氧化剂：氧化剂： 氧化型谷胱甘肽氧化型谷胱甘肽; 碱性下通空气。碱性下通空气。 复性区复性区 多聚物生成区多聚物生成区 絮凝沉淀区絮凝沉淀区 盐酸胍浓度盐酸胍浓度mol/L 红血球碳酐酶复性操作中变性剂红血球碳酐酶复性操作中变性剂 与蛋白质浓度对复性的影响与蛋白质浓度对复性的影响 蛋白质浓度蛋白

59、质浓度 mol/L 87 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在E.coliE.coli 中的高密度发酵过程中以两种形式表达：中的高密度发酵过程中以两种形式表达： 细胞内有活性的可溶性蛋白形式（约占目细胞内有活性的可溶性蛋白形式（约占目 标蛋白的标蛋白的30%30%） 无活性的包涵体形式（约占目标蛋白的无活性的包涵体形式（约占目标蛋白的 70%70%）。）。 悬浮破壁悬浮破壁PBS洗涤洗涤离心离心 硫铵沉淀硫铵沉淀 亲和层析亲和层析阳离子交换层析阳离子交换层析 溶解溶解复性复性亲和层析亲和层析 湿菌体湿菌体 发酵液发酵液 干净菌体干净菌体 上清液上清液 包涵体包涵

60、体 纯品纯品 活性检测活性检测 破壁液破壁液 离心离心 离心液离心液 洗涤洗涤 举例：举例：TRAIL的分离纯化的分离纯化 88 1. 1. 包涵体的洗涤包涵体的洗涤 粗制包涵体用粗制包涵体用 50mM50mM磷酸盐缓冲液，含磷酸盐缓冲液，含150mM NaCl pH=7.4 150mM NaCl pH=7.4 (1:3 w/v)(1:3 w/v)洗涤洗涤2-32-3次；次； 用含有用含有1M NaCl1M NaCl的磷酸缓冲液洗涤的磷酸缓冲液洗涤1 1次次 (1:3 w/v)(1:3 w/v)，将粘附，将粘附 其表面的大部分蛋白及水溶性杂质除去；其表面的大部分蛋白及水溶性杂质除去； 用用6M